拟南芥器官发生及体细胞胚发生相关基因的表达模式分析

摘要

植物细胞具有全能性，任何一个细胞都有发育成完整个体的潜在能力。其主要体现在植物组织培养中的脱分化、分化、器官形成或胚胎发生直到完整植株的形态建成等一系列过程中。离体器官发生是指培养条件下植物的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定芽，不定根或花芽等器官的过程。体细胞胚胎发生是指离体条件下植物的体细胞通过与合子胚发生相类似的途径发育成新个体的过程。目前，有关不定芽再生及体细胞胚发生的分子机理和基因调控研究还很少，有待展开系统的研究。 本研究以发育成熟的拟南芥种子为外植体，建立了高频率不定芽再生的离体培养体系。详细地研究了离体器官发生和不定芽再生的形态学和组织学变化，分析了器官发生相关基因miR165α，miR166α，REV在该发育过程中的时空表达模式，并分析了生长素极性分布在离体器官发生过程中的作用，为理解离体器官发生和不定芽再生的发育过程及其分子机理提供重要信息。 另外，利用拟南芥成熟种子获得分化与非不分化的愈伤组织，并分析体细胞胚发生相关基因在上述愈伤组织中的表达变化，为深入研究体细胞胚发生的分子机制奠定了基础。 主要研究结果如下： 1．高频率不定芽再生培养体系的建立 利用Co1-0生态型拟南芥成熟种子为外植体，通过施加一定浓度的2，4-D，从茎顶端分生组织区诱导产生器官原基（叶原基），并可进一步发育形成叶片状结构，还可在生长素的作用下，形成次级叶原基。去除生长素之后，上述器官原基和叶片状结构可进一步发育为不定芽。 2．器官发生相关基因的时空表达模式分析 利用miR165α：：GUS，miR166α：：GUS，REV：：GUS转基因拟南芥种子，建立了相同的不定芽再生培养体系，并通过GUS染色法分析了这些基因的时空表达模式。结果显示，miR165α在球形突起形成早期不表达，而在膨大的突起单侧或两侧表层一至几个细胞中表达，随后其表达区域扩展至整个侧面，故推测它们在体外叶原基起始中起作用，miR166α过表达可促进不定芽的发生，进一步说明它们在不定芽再生中起重要作用；miR165α/166α在叶片状结构和不定芽的背侧表达，表明其与器官腹-背极性建立有关；miR165α亦在叶片状结构外侧一至几个细胞中表达，该处产生新的叶原基，表明其与次级叶原基的起始有关。以上结果表明其在不定芽的起始及发育中均起重要作用。 REV在整个器官原基中表达，亦在不定芽子叶尖端和整个维管组织中表达，说明其在叶器官起始、发育和维管组织发育中起重要的作用。 3．生长素极性分布方式 利用能够反映生长素最大积累量的DR5：：GUS报告子，来研究生长素在离体器官发生和不定芽再生过程中的分布情况。结果表明，生长素在叶原基、幼叶顶端的部分细胞中积累，最后集中分布在不定芽的基部细胞中，从而在该处产生大量不定根。这些结果说明，在不定芽的发育过程中，生长素的集中积累与器官发生的位置和不定根的产生有关。 4．拟南芥分化与不分化愈伤组织的获得及WUS在体细胞胚发生中的表达分析 获得了三种不同类型的拟南芥愈伤组织，即绿色粉粒状、非胚性愈伤组织，其不能分化再生新植株；淡黄色、颗粒状和黄绿色、瘤状胚性愈伤组织，这二者能够再生植株。为了进一步研究WUS在体外培养中对愈伤组织分化的作用，利用RNA原位杂交分析了WUS在分化与不分化组织中的表达变化。结果表明，在分化愈伤组织中，WUS在体细胞胚发生过程中的表达模式呈规律性变化，而在不分化愈伤组织中未检测到其表达，故推测其在体细胞胚发生中起重要作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

1顶端分生组织的结构及功能维持

2叶器官的发生发育及调控

2.1叶原基的起始及调控

2.2叶腹-背轴的发育及调控

2.3叶基-顶轴发育及调控

2.4叶中-边轴发育及调控

3体细胞胚发生的研究进展

3.1体细胞胚的起源及发生发育

3.2体细胞胚胎发生基因及其表达调控的研究

3.3植物激素与体细胞胚发生

4离体器官发生研究进展

4.1离体器官发生的方式

4.2离体器官发生的调控

4.3植物激素与离体器官发生

第一章不定芽再生培养体系的建立及器官发生相关基因的时空表达模式分析

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1拟南芥高频率不定芽再生体系的建立

2.2不定芽再生过程中相关基因的半定量RT-PCR分析

2.3 miR166a过表达对不定芽形成的影响

2.4 miR165/166的时空表达模式分析

2.5 REV的时空表达模式分析

2.6生长素的极性分布模式分析

3讨论

3.1体外培养下高频率不定芽再生体系的建立

3.2 miR165/166在不定芽发生及其发育过程中的作用

3.3 REV在不定芽诱导及再生过程中的作用

3.4生长素的极性分布方式

第二章拟南芥分化与不分化愈伤组织中体细胞胚发生相关基因的表达分析

1材料与方法

2结果与分析

2.1不同生态型拟南芥再生培养体系的建立

2.2拟南芥分化与不分化愈伤组织的获得

2.3分化与不分化愈伤组织中干细胞相关基因的表达差异

2.4分化与不分化愈伤组织中WUS的表达分析

3讨论

参考文献

附录

攻读硕士期间完成的学术论文

致谢