26肽蜂毒素与基因变构人白细胞介素2嵌合蛋白的原核表达、纯化及活性测定

摘要

①目的:通过定点诱变的方法,构建基因变构IL-2(<'88>N→R)的重组克隆;将26肽蜂毒素与基因变构的人IL-2在基因水平连接,构建嵌合体蛋白克隆并在原核系统中高效表达,并进行初步纯化和抗原性检测.②方法:从一名健康男子的扁桃体细胞中分离T细胞经PHA刺激活化后,提取细胞的RNA为模板,逆转录构建cDNA文库,经套式PCR扩增出编码IL-2的基因,插入T-A载体后获得编码天然IL-2的克隆,核苷酸测序证实成功后,自行设计含有突变位点的引物,利用重组PCR技术,进行定点诱变构建基因变构IL-2(<'88>N→R)的重组克隆,DNA测序确认变构成功.利用剪接式重叠延伸(spliced overlap extension,SOE)技术在26肽蜂毒素与基因变构IL-2的基因之间导入四个易形成空间结构的氨基酸残基组成的连接肽(Gly<,4>Ser)<,3>,构建嵌合体蛋白的基因,克隆到原核表达载体pGEX4T-2中,重组质粒转化宿主菌DH5 α,经IPTG诱导表达目的融合蛋白,蛋白纯化后经SDS-PAGE电泳与Western blotting鉴定.③结果:获得了基因变构IL-2的编码基因克隆及表达嵌合蛋白的重组菌,并得到纯化的融合蛋白和Thrombin酶切后的嵌合蛋白;Western blotting鉴定表明纯化的重组蛋白与人IL-2的单克隆抗体有良好的抗原特异性.④结论:在原核表达系统中成功表达了嵌合蛋白,纯化后的蛋白有望是一种新型免疫调节剂,为进一步在真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型细胞因子类免疫调节剂药物奠定基础.

目录

摘要

Abstract

前言

材料和方法

1、材料

1.1质粒和细菌

1.2仪器与试剂

2、方法

2.126肽蜂毒素基因的获得

2.2IL-2变构基因的克隆构建

2.3蜂毒素与基因变构IL-2嵌合蛋白原核表达载体的构建

2.4重组菌的诱导表达

2.5重组融合蛋白的纯化及酶切

2.6蛋白的SDS-PAGE电泳分析

2.7表达蛋白的Western blotting鉴定

结果

3.1蜂毒素与变构IL-2嵌合蛋白表达载体的构建

3.2嵌合体蛋白的PCR产物及表达载体的酶切鉴定

3.3嵌合体蛋白的序列测定

3.4重组质粒pGEX4T-2/嵌合蛋白在E.coli DH5 α中的表达

3.5融合蛋白的纯化

3.6Westernblotting鉴定

讨论

小结

参考文献

附录

文献综述：细胞因子白细胞介素养-2（IL-2）研究进展

致谢