针对VEGF的siRNA对人子宫内膜癌细胞系ishikawa细胞中VEGF表达及细胞增殖的影响

摘要

目的: 研究针对VEGF的小分子干扰RNA(siRNA)介导的RNA干扰(RNAi)技术对人子宫内膜癌细胞系ishikava细胞中VEGF基因及蛋白的靶向抑制作用，观察对细胞增殖的影响及形态的变化，探讨针对VEGF的siRNA介导RNAi技术的在子宫内膜癌基因治疗的应用前景。 方法: 根据siRNA序列设计原则，设计并合成针对VEGF-165序列特异性小干扰RNA(siRNA)及阴性对照siRNA，应用德国QIAGEN公司RNAiFectTM Transfection试剂盒转染ishikava细胞，分别于转染后12h、24h、48h、72h、7d后提取细胞RNA，应用实时荧光定量PCR检测其对VEGF mRNA表达水平的影响，Western Blot方法检测VEGF蛋白的表达水平，MTT法及细胞计数法检测细胞增殖的情况。 结果: (1)实验组的细胞明显变形、皱缩、变圆并开始脱落，内见凋亡小体。 (2)荧光定量PCR检测发现转染后12h、24h、48h、72h VEGF mRNA表达水平明显下降，与对照组相比差异有统计学意义(Q值依次为6.44、8.75、19.23、7.34，P均＜0.05)，于转染后7天这种抑制作用消失(P=4.26，P＞0.05)； (3)Western Blot方法检测发现转染后12h、24h、48h、72h VEGF蛋白表达明显减弱(F值依次为19.7、79.6、203.1、58.2，P均＜0.05)，与对照组相比差异有统计学意义，于转染后7天这种抑制作用消失(F=3.2，P＞0.05)； (4)MTT法检测发现转染后12h-72h，实验组细胞增殖抑制率与相同时间点各对照组相比明显增高，差别有统计学意义(F值依次为20.4、25.1、40.6、23.4，P均＜0.05)，转染后7天这种抑制作用消失，差别无统计学意义(F：9.1，P＞0.05)； (5)细胞计数法发现转染后12h-7d，实验组细胞数均明显低于相同时间点各对组(F值依次为4.23、6.86、7.12、12.1，P均＜0.05)。 结论: 针对VEGF的RNAi技术可有效抑制子宫内膜癌细胞系ishikawa细胞中VEGF基因及其蛋白的的表达，抑制细胞的生长增殖，且VEGF的表达的变化趋势与细胞增殖变化趋势一致，提示VEGF在子宫内膜癌的发生、发展中具有重要作用，针对VEGF的RNA干扰技术为子宫内膜癌基因治疗提供了新策略，为进一步利用RNAi技术抑制肿瘤生长、血管形成及局部侵袭和远处转移提供研究基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章材料和方法

1.1研究对象、主要仪器及设备

1.2实验方法

1.3统计学处理

第二章结果

2.1细胞转染

2.2总RNA完整性测定

2.3相对标准曲线

2.4RNAi后ishikawa细胞中VEGFmRNA表达的检测

2.5RNAi后ishikawa细胞中VEGF蛋白表达的检测

2.6 MTT对ishikawa细胞增殖的检测

2.7细胞计数法检测siRNA转染对培养细胞数量的影响

第三章讨论

3.1封闭VEGF作用与抗肿瘤血管新生的治疗

3.2 RNAi技术的作用原理机制

3.3 RNAi抑制子宫内膜癌VEGF表达实验研究

结论

参考文献

综述：VEGF在子宫内膜癌中的表达及RNAi技术在妇科肿瘤中的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢