小麦外源抗黄矮病基因Bdv2的标记开发及对突变体的鉴定

摘要

小麦黄矮病（wheatyellow dwarf disease，WYD）是小麦的主要病害之一，是由蚜虫传播的大麦黄矮病毒（BYDV）引起，常造成巨大损失。小麦的近缘种—中间偃麦草对大麦黄矮病毒具有高度抗性，已至少包含三个抗黄矮病基因，分别定位于7St、7E、和2Ai—2染色体上。其中有一个基因被精确定位在中间偃麦草7X（St）染色体长臂端部，被命名为Bdv2。通过远缘杂交与生物技术已将中间偃麦草的黄矮病抗性基因（Bdv2）导入普通小麦基因组，选育出抗黄矮病的小麦．中间偃麦草易位系HW642等。为了检测追踪通过远缘杂交导入小麦背景的外源染色体，使用含外源染色体的附加/易位系及其亲本材料，基于小麦第七群已定位EST，开发外源染色体特异的EST—PCR标记，旨在快速有效地追踪和检测与小麦第七同源群抗黄矮病基因相连锁的标记，本试验共设计了75对基于定位在小麦第七同源群染色体上的EST引物，在AGE—PAGE—SSCP分离扩增产物，筛选出中间偃麦草抗黄矮病7XL染色体特异标记14对（比率是18.7％），标记开发结果表明，利用小麦已定位EST开发小麦近缘种特异的EST—PCR标记是可行的。而且这些EST—PCR标记不同于中间偃麦草2Ai—2染色体抗黄矮病基因，14个EST—PCR标记与Bdv2相连锁的那条特异带已经克隆测序并通过序列分析，结果指出这些特异带的序列信息显示了很高的同源性与原始wEST的序列，BLAST结果也显示了这些序列分别编码蛋白激酶P450，中心蛋白（RCA），转导蛋白（G—蛋白亚基）和假定的蛋白。 因携带Bdv2的中间偃麦草染色体片段与小麦部分同源染色体亲缘关系远、很难发生交换分离，难以精细定位Bdv2与分子标记之间的遗传距离，分离抗黄矮病基因非常困难。然而，创造不同类型的抗黄矮病基因Bdv2感病突变体，可为Bdv2、分子标记精细定位、Bdv2基因分离和研究Bdv2介导的抗黄矮病机制提供坚实的材料基础。本试验采用两种诱变方法获得突变群体，一种是化学诱变剂甲基磺酸乙酯（Eethyl methanesulfonate）EMS诱变处理小麦HW642种子，另一种60Co—γ辐射诱变小麦HW642雌配子成熟期（开花前2～3天）进行成株辐射，后与普通小麦杂交，将获得的M2代材料接种毒蚜BYDV—GAV，进行了生物学性状与一些农艺学性状的鉴定，并对M2代接种进行表型感病鉴定，EMS表型发病变异率约为13.7％，在分子水平上，检测突变频率是7.3％；60Co—γ表型发病变异率约为10.7％，在分子水平上，检测突变频率是58.3％。部分感病突变体通过基因组原位杂交得到了进一步验证，本研究所构建的两个突变体库有望有效的应用于小麦抗病功能基因研究和小麦遗传改良中。

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论文说明：缩略语表　图表目录

声明

1 引言

1.1 小麦黄矮病研究现状

1.1.1 大麦黄矮病毒的特性和传播特性

1.1.2 小麦抗BYDV育种研究

1.1.3 小麦黄矮病抗性育种发展方向

1.2 外源渐渗种质的检测

1.2.1 分子标记检测外源种质

1.2.2 EST在作物研究中的应用

1.3 小麦突变体的创造及利用

1.3.1 自发突变的收集及利用

1.3.2 人工诱变突变体的构建及其利用

1.3.3 有益性状突变植株筛选和鉴定的方法

1.4研究目的和技术路线

1.4.1 研究目的

1.4.2 技术路线

2材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2 分子标记检测的突变体材料

2.2试验方法

2.2.1 EST-PCR标记的开发

2.2.2植物基因组DNA的提取(采用CTAB法提取)

2.2.3 BSA分池

2.2.4 wEST序列引物设计

2.2.5 PCR扩增

2.2.6 PCR产物分离

2.3特异带的回收、克隆测序及比对

2.3.1 PCR产物回收

2.3.2 PCR产物的克隆测序

2.3.3菌落PCR反应体系

2.3.4 菌液的保存

2.4 小麦感黄矮病突变体的创造

2.4.1 EMS诱变小麦产生感病突变体

2.4.2 60Co-γ射线诱变小麦产生突变体

2.5 分子标记在检测小麦诱变变异中应用的研究

2.5.1 DNA样本提取

2.5.2分子标记

2.5.3 基因组原位杂交

3 试验结果与分析

3.1 与Bdv2基因连锁的EST-PCR标记的开发结果

3.1.1 特异引物在亲本基础材料的扩增结果

3.1.2特异引物在HW642/中8601的F2群体的扩增结果

3.1.3特异引物在中间偃麦草2Ai-2染色体上的扩增结果

3.1.4特异带的回收克隆测序及信息比对

3.2 EMS和60Co-γ诱变处理对小麦生长的影响

3.2.1 EMS诱变处理对小麦生长的影响

3.2.2 60Co-γ射线诱变处理对小麦生长的影响

3.3 分子标记检测检测突变体结果分析

3.3.1 EMS诱变处理的检测结果HW642不同突变类型多态性分析

3.3.2 60Co-γ射线诱变处理的检测结果HW642不同突变类型多态性分析

3.3.3 引物在两种不同诱变处理的检测结果

3.3.4感病突变体的验证结果

3.3.5 比较作图

4讨论

4.1 EST-PCR分子标记

4.2 小麦感病突变体的表型变异

4.3 小麦突变体的分子水平检测

5 结论

致 谢

参 考文献

作 者 简 介