TNF-α和nNOS在红霉素预适应大鼠局灶性脑缺血损伤保护作用中变化的研究

摘要

目的： 缺血预适应(Ischemic Preconditioning，IP)是指组织和机体在经受非致死的缺血损伤后对以后长时间的缺血损伤产生显著的耐受性，是机体的一种重要的保护机制。缺血预适应在多种动物得到证实，并且存在于机体的其他众多器官，比如心脏，骨骼肌，脊髓，肺，肝脏，肾脏，胃，小肠等。深入研究预适应现象有助于我们在医疗过程中保护机体功能，具有诱人的临床应用前景。 现在有人根据引发预适应因子的不同将预适应分为缺血预适应和化学预适应，化学预适应是指利用一些可以轻度干扰能量代谢的化学物质模拟缺血的改变从而诱导预适应得保护作用的一种做法。目前在研究中经常用于化学预适应得物质有CoCl2，DFO，3-NPA等等，但是这些物质因为它们的毒副作用限制了它们的临床应用。最近Huber等发现临床常用的一些抗生素如红霉素可以诱发机体产生预适应得保护作用，从而减少缺血对神经系统的损害。红霉素可以通过干扰线粒体的能量代谢从而模拟缺血诱发预适应的保护作用。研究还表明预适应除了可以保护脑组织免受缺血损害还可以对其他的损伤起到保护作用，如癫痫，脑水肿等。 关于预适应的保护机制的研究表明很多的因素参与到这一过程中，其中神经型一氧化氮合酶(Neuronal nitric oxide sythases，nNOS)和肿瘤坏死因子( TNF-α)的作用日益受到关注。已有实验证明在一些预适应过程中nNOS通过调控凋亡相关基因如Caspase3，Bcl-2等的表达发挥保护作用，而TNF-α也是目前缺血缺氧预适应研究最多的因子，是哺乳动物不同组织、细胞形成缺氧耐受共同的分子生物学机制。但是在红霉素预适应的过程中nNOS和TNF-α是否起作用，通过什么途径起到作用，现在还没有相关的报道。为此，我们研究TNF-α和nNOS在红霉素预适应大鼠局灶性脑缺血损伤保护作用中的变化，为进一步揭示红霉素预适应对大鼠局灶性脑缺血损伤保护作用的机制提供实验依据。 实验方法 1、实验动物及分组 健康Wistar雄性大鼠，体重270-300g，有中国医科大学动物部提供。将108只雄性大鼠随即分成3大组，每组再随即分成6小组，每小组6只，分别为为对照组和5mg/kg，20mg/kg，35mg/kg，50mg/kg，65mg/kg红霉素预适应的5个实验小组。每大组分别用于TTC染色法脑缺血体积测定，脑水肿测定和RT-PCR检测法及Western blot法测定nNOS及TNF-α的mRNA和蛋白表达。 2、大鼠局灶性脑缺血模型的建立 采用右侧颈内动脉插入线栓法制备大鼠右侧局灶性脑缺血模型。动物苏醒后表现为：①提尾时左前肢内收屈曲；②爬行时项左侧划圈；③站立时向左倾倒。凡具有上述三项体征之一者入选。 3、TTC染色 将缺血后24小时的实验组和对照组大鼠，迅速断头取脑，从前向后每2mm切片，共切6张。将脑片放入1％TTC生理盐水中，37℃避光孵育30分钟，待显色完全(正常脑组织呈红色，损伤组织呈白色)后，置甲醛溶液中固定。 4、脑组织梗死体积测定 应用图像分析软件计算脑梗死面积及各层面积，由公式V=∑(A1+A2)t/2算出梗死体积。其中t为切片厚度，A1和A2分别表示切块嘴、尾侧梗死面积，同样方法计算出同侧大脑半球体积，计算出梗死灶体积占大鼠脑体积的百分比。 5、组织含水量测定 将对照组和5个实验组的大鼠，在缺血后48小时立即断头取脑，立即将脑分别置于电子天平(1/10000)称重后放于烤箱中恒温100℃，持续48小时取出称干重，计算脑含水量=[(湿重-干重)/湿重]×100％。 6、脑组织的取材 将对照组和五个实验组脑缺血模型大鼠饲养24小时后，大鼠麻醉后迅速短头取脑，切取右侧缺血侧大脑半球半暗带区皮质(距嗅球尖端7-11mm，矢状裂至外侧裂上1/3)收集于EP管，-70℃冰箱保存。 7、RT-PCR法测定nNOS和TNF-α mRNA的表达 将组织经过一系列的RT-PCR反应获得的PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，用电泳凝胶成像仪测定扩增带密度来评估其表达。以TNF-α及nNOS和GAPDH的比值作为TNF-α和nNOS表达的标准值。 8、Western blot法检测nNOS和TNF-α蛋白的表达 用ECL试剂盒采用化学发光法显示出TNF-α和nNOS的含量，β-actin作为内参，Westem blot结果用软件(Chemi Imager5500 V2.03)扫描，并用图像分析系统定量分析。 9、统计方法 统计学处理用SPSS13.0统计软件包对数据进行处理，实验数据以均数±标准差(-x±s)表示，各组间两两比较用t检验，检验水准a=0.05。 结果： 1、脑梗死体积测定结果 经过红霉素预适应的5个实验组大鼠的局灶性脑缺血24小时，其脑梗死体积较对照组脑缺血体积均有不同程度的减少，而且按35mg/kg剂量给予预适应的实验组脑缺血梗死体积减少最为显著。 2、脑水肿测定结果 给予不同剂量红霉素预适应的实验组，在鼠脑急性缺血后48小时的脑水肿程度均比对照组有所减轻，而且给予35mg/kg剂量的实验组效果较其他组更有显著性差异。 3、RT-PCR检测法和Western blot法测定nNOS及TNF-α的mRNA和蛋白的表达结果 实验组较对照组可以上调nNOS mRNA和蛋白的表达和下调TNF-α mRNA和蛋白的表达。 4、图像分析及统计学分析 经红霉素预适应的实验组，脑缺血24小时后，大鼠局灶性脑缺血体积较对照组减小，根据给药剂量不同，减少的程度也不同，35mg/kg剂量组脑缺血梗死体积减少最为显著(P<0.05)；经红霉素预适应的实验组，在脑缺血后48小时的脑水肿程度也较对照组有所减轻，35mg/kg剂量组脑水肿程度较对照组减轻尤为显著(P<0.05)；经红霉素预适应的实验组，缺血侧半暗袋脑组织中经RT-PCR检测法和Western blot法检测的nNOS及TNF-α的mRNA和蛋白的表达，结果各实验组中nNOS的mRNA和蛋白的表达有所增加，TNF-α的mRNA和蛋白的表达有所减少，35mg/kg剂量组nNOS及TNF-α的mRNA和蛋白的表达量较对照组的差异性最大(P<0.05). 结论： 1、红霉素预适应后，对大鼠局灶性急性脑缺血损伤具有保护作用，能明显减少脑缺血后的脑梗死体积及脑水肿的严重程度，并且35mg/kg剂量为最适红霉素预适应剂量。 2、红霉素预适应能提高大鼠脑缺血模型中nNOS mRNA和蛋白的表达，并且也能降低TNF-α mRNA和蛋白的表达，提示红霉素预适应的脑缺血保护机制可能与nNOS和TNF-α有关。

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综述 缺血预适应对脑的保护机制

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