HIV/AIDS患者外周血B细胞数量及TLR7与TLR9 mRNA表达水平的研究

摘要

目的： B细胞是介导抗病毒体液免疫最重要的细胞，在机体的免疫系统中扮演重要角色，B细胞数量与功能紊乱，直接影响有效的抗病毒免疫应答。新近研究发现，B细胞作为适应性免疫应答细胞，却表达重要的“天然”模式识别受体—-Toll样受体(Toll—like receptor，TLR)7与9。TLR7主要识别病毒单链RNA(ssRNA)；TLR9明确识别的天然配体是CpG—DNA，广泛存在于细菌和病毒基因组中。TLR7与TLR9信号通路活化决定和影响B细胞的免疫功能。 目前，对HIV/AIDS患者外周血B细胞数量变化的研究结论不甚明确。中国HIV/AIDS患者B细胞数量变化的研究尚未见报道。HIV/AIDS患者B细胞TLR7与TLR9mRNA表达水平如何，是否在HIV感染进程中发挥重要作用尚不明确。本文以中国辽宁未经高效抗逆转录病毒治疗的HIV/AIDS患者为研究对象，研究HIV/AIDS患者外周血B细胞数量及B细胞TLR7与TLR9mRNA的表达水平，探讨B细胞数量及TLR7与TLR9mRNA的表达水平与HIV感染疾病进程的关系，有助于我们深入了解HIV感染中与B细胞相关的致病机制，从而为艾滋病疫苗及其佐剂的研发开辟新径。 方法： 1、研究对象 1)由中国医科大学艾滋病研究所确认实验室经Western blot试验确认为HIV阳性的HIV/AIDS患者27例，年龄分布为20～72岁(41.9±13.1岁)，未接受抗病毒治疗。根据HIV/AIDS患者感染时间和CD4+T细胞数量分为典型进展HIV组(HIV组)：感染时间>5年，CD4+T细胞数量≥200个/μl，无艾滋病指征性疾病；典型进展AIDS组(AIDS组)：感染时间>5年，CD4+T细胞数<200个/μl，和/或合并艾滋病指征性疾病。 2)16例HIV抗体阴性、未暴露于HIV的健康者为阴性健康对照，性别、年龄与研究对象匹配，年龄分布为25～47岁(35.1±9.3岁)。 3)采集研究对象外周静脉血10ml。调查及采血前均征得研究对象同意，并签署知情同意书。 2、T细胞与B细胞绝对值和比值测定 将20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂或20μl CD3/CD16+56/CD45/CD19TriTEST分别加入绝对计数管中，应用逆向加样法各加入50μl抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，FACS MULTISET软件检测并进行自动分析，计算CD4+T细胞、CD8+T细胞与CD19+B细胞绝对值与比值。 3、密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC) 将PBS稀释后的抗凝全血30ml沿管壁缓慢加至10ml Ficoll PaqueTM Plus淋巴细胞分离液液面上，400g、30min离心。吸取PBMC层移入另一离心管中。补充PBS至45ml，洗涤细胞2次后得到PBMC。 4、CD19+B细胞分选 应用MACS磁珠分选系统分选CD19+B细胞，严格按照说明书进行操作。每107PBMC细胞加80μl缓冲液与20μlCD19免疫磁珠，4℃孵育15min，每107细胞加2ml缓冲液洗涤细胞，300g、10 min离心，500μl缓冲液重悬细胞，使用LS柱子进行阳性分选。取106细胞加入20μl CD20-PE室温避光孵育25分钟，洗涤后进行流式细胞仪检测，应用Cellquest软件进行细胞纯度分析。 5、提取CD19+B细胞RNA，逆转录成cDNA 采用Qiagen公司的试剂盒RNeasy mini kit提取CD19+B细胞总RNA。使用紫外分光光度仪检测RNA浓度及纯度。取20μl总RNA，加入2μl Oligo(dT)15配制成RNA/引物混合物22μl，70℃5min热休克，立即冰上放置5min。用Promega公司的试剂盒ImProm—Ⅱ Reverse Transcription System逆转录合成cDNA。逆转录反应体系：ImProm—Ⅱ5×Reaction Buffer10μl，MgCl212μl，dNTP2.5μl，Recombinant RNasin() Ribonuclease Inhibitor20U，ImProm—Ⅱ Reverse Transcriptase2.5μl。向RNA/引物混合物中加入上述逆转录反应体系28μl(总体积50μl)。逆转录条件：25℃5min；42℃1h；70℃15min。所得cDNA于—20℃冰箱冻存备用。 6、实时定量PCR 设计目的基因TLR7、TLR9和内参GAPDH特异性引物，由invitrogen公司合成。采用ABI公司的SYBR Green试剂盒，应用ABI7500荧光定量PCR仪进行定量检测。25μl实时PCR反应体系：2×Power SYBR() Green PCR Master Mix12.5μl，上下游引物各1μl，cDNA模板2μl，RNase—free water8.5μl。反应条件：95℃10min热启动，95℃15sec变性、60℃1min退火及延伸40个循环。反应结束后进行融解曲线分析引物的特异性。用相对定量2—()()Ct法比较各组间TLR7或TLR9的mRNA相对表达差异。每一份标本均行复管检测，取其均值做为目的基因的表达水平。 7、统计学处理 所有资料采用SPSS16软件分析。数据均值±标准差表示，符合正态分布的数据采用单因素方差分析，并进行均数两两比较，使用Pearson进行相关性分析，不符合正态分布的数据采用Mann—Whitney U test进行比较，使用Spearman rank进行相关性分析，统计概率采用双侧检验，P<0.05时有统计学意义。 结果： 1、中国HIV/AIDS患者外周血T细胞与B细胞绝对计数检测结果 HIV/AIDS患者CD4+T细胞数量为(348.2±182.3)个/μl，显著低于健康对照组(821.7±217.8)个/μl，P=0.000；HIV组与AIDS组CD4+T细胞数量分别为(415.3±154.9)个/μl与(138.6±58.1)个/μl，均显著低于对照组，P=0.0000。HIV/AIDS患者B细胞数量为(149.5±40.1)个/μl，显著低于健康对照组(209.1±102.6)个/μl，P<0.05；其中，HIV组与AIDS组B细胞数量分别为(152.0±42.2)个/μl与(141.3±33.6)个/μl，均显著低于健康对照组，P<0.05。HIV组与AIDS组外周血B细胞百分数分别为(7.1±2.7)％与(8.6±3.4)％，与健康对照组(9.2±5.5)％相比无差异。 2、中国HIV/AIDS患者外周血B细胞与CD4+T细胞、CD8+T细胞的相关性 HIV/AIDS患者外周血B细胞数量与CD4+T细胞数量显著正相关(r=0.534，P=0.006)；与CD8+T细胞数量不相关(r=0.301，P=0.107)。 3、CD19+B细胞分选纯度 应用MACS磁珠分选系统分选CD19+B细胞，分选所得细胞用流式细胞仪测定纯度，CD19+B细胞纯度大于90％。 4、HIV/AIDS患者外周血B细胞TLR7与TLR9 mRNA表达与健康对照组的比较 HIV/AIDS患者外周血B细胞TIR9 mRNA的表达明显低于健康对照组(P=0.023)。HIV组TLR9 mRNA的表达与健康对照组相比无显著差异，P=0.05；AIDS组TLR9 mRNA的表达明显低于健康对照组(P=0.042)。各组间TLR7 mRNA的表达无统计学意义(P>0.05)。 5、HIV/AIDS患者外周血B细胞TLR7与TLR9 mRNA表达与健康对照组CD4+T细胞的相关性 HIV/AIDS患者外周血B细胞TLR9 mRNA的表达水平与CD4+T细胞数量正相关(r=0.390，P=0.040)。HIV/AIDS患者外周血B细胞TLR7 mRNA的表达水平与CD4+T细胞数量不相关。 结论： 1、HIV/AIDS患者外周血B细胞数量减少，而且B细胞数量与CD4+T细胞数量显著正相关，提示HIV感染中B细胞数量变化可能与疾病进程紧密相关。 2、HIV/AIDS患者B细胞TLR9 mRNA的表达与健康对照相比明显下降，而且B细胞TLR9 mRNA的表达量与CD4+T细胞数正相关，提示TLR9 mRNA表达可能与疾病进程相关。

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实验结果

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结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述：Toll样受体及其在HIV/AIDS疾病中的研究进展

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