Dsg3刺激下寻常型天疱疮患者外周血T淋巴细胞增殖检测分析

摘要

寻常型天疱疮(Pemphigus vulgaris，PV)是一种慢性、复发性、大疱性皮肤病，主要表现为皮肤及粘膜上出现极易破裂的水疱，其病理基础是棘层细胞松解，细胞间粘连的丧失，发生这种病理改变的直接原因是PV患者体内存在局部的或循环的IgG型自身抗体，该抗体与角质形成细胞(keratinocyte，KC)表面的抗原分子结合后作用于桥粒中的一种糖蛋白——桥粒芯糖蛋白3(desmoglein3，Dsg3)，导致细胞间粘附能力丧失，而导致PV的发生。这种病变可以通过被动转移患者的IgG给新生小鼠而重现，说明体液免疫在PV的发生过程中起重要作用。随着免疫学技术和分子生物学技术的发展，越来越多的研究结果表明T淋巴细胞在PV发病过程中也起着重要的作用。除分泌各种细胞因子直接参与疾病的发生发展之外，Th2细胞在识别MHC II类抗原、B细胞激活、抗体产生以及靶器官的破坏等各个方面均起重要作用。 本实验采用流式细胞仪四荧光染色法检测Dsg3刺激下PV患者外周血Th1和Th2型T淋巴细胞表达水平的变化；采用5-BrdU掺入法检测CD4+T淋巴细胞的增殖情况，初步探讨寻常型天疱疮患者发病与自身反应性T淋巴细胞活化与增殖之间的关系。 材料和方法 一、病例和主要试剂 1、PV患者组 PV患者12人，均为中国医科大学附属第一医院皮肤科住院患者，所有病例均经临床、组织病理及免疫病理证实为寻常型天疱疮；健康献血者22名作为正常对照。 2、标本的采集与处理 采研究对象外周静脉血10ml，EDTA-k抗凝后8小时内提取外周血单个核细胞(PMBC)。 3、Dsg3来源 稳定转染的HELA细胞株。 4、主要试剂 淋巴细胞分离液、RPMI1640培养基、胎牛血清，为Hyclone公司产品；植物血凝素(PHA)为Sigrna公司产品；荧光标记抗体(抗人CD3-APC、抗人CD4-PECy5、抗人IL-4-PE、抗人IFN-γ-FITC)、Cytofix/CytopermTM Plus Fixation/PermeabilizationKit、FITC BrdU Flow Kit、BD GolgiStopTM、24孔培养板均购自BD公司；Ni-NTApurification system、G418(Geneticin)为Invitrogen公司产品；一次性滤器(0.22μm)为Millipore公司产品。 5、主要仪器和设备 流式细胞仪，FACS Calibur，ND1000，(BD公司，美国)；AKTA purifior(通用公司，美国)；CO2培养箱(Harris HW0301 T-VBA型，德国)；低温离心机(日立，日本)；超净工作台(国产)。 二、实验方法 1、寻常型天疱疮抗原Dsg3的获得； 2、外周血单个核细胞(PBMC)的提取； 3、T淋巴细胞的活化及分组培养： 空白对照阴性对照实验组阳性对照 PBMC PBMC PBMC+Dsg3 PBMC+PHA 4、培养后Th1/Th2型T淋巴细胞的测定； 5、5-BrdU掺入法检测CD4+T淋巴细胞的增殖。 实验结果 一、培养后各组Th1/Th2型T淋巴细胞的测定结果 1、Dsg3刺激下PV患者的Th2型T淋巴细胞比例高于不加任何刺激的阴性对照组； 2、Dsg3刺激下PV患者的Th1型T淋巴细胞比例与不加任何刺激的阴性对照组比较无明显差异； 3、在Dsg3刺激下，PV患者Th2型T淋巴细胞比例显著高于正常人； 4、在Dsg3刺激下，PV患者Th1型T淋巴细胞比例低于正常人； 5、未经任何刺激时，PV患者Th2型T淋巴细胞比例显著高于正常人； 6、未经任何刺激时，PV患者Th1型T淋巴细胞比例低于正常人。 二、5-BrdU掺入法检测CD4+T淋巴细胞增殖的结果 1、PV患者在Dsg3刺激后发生增殖的CD4+T淋巴细胞显著高于正常人； 2、PV患者在Dsg3刺激后发生增殖的CD4+T细胞高于不加任何刺激的阴性对照组。 结论： 1、寻常型天疱疮抗原Dsg3可诱导PV患者T淋巴细胞发生特异性增殖； 2、PV患者外周血T淋巴细胞为Th2优势型，在Dsg3的刺激下进一步升高，Th2型T淋巴细胞可能与PV发病相关； 3、本实验尚未发现Th1型T淋巴细胞与PV发病间的联系。

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实验结果

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结论

本研究的创新性自我评价

参考文献

综述T淋巴细胞与寻常型天疱疮发病之间的联系

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