Rac1基因对人纤维肉瘤HT1080细胞侵袭Ⅰ型胶原蛋白屏障的影响及机制研究

摘要

背景和目的：在原发肿瘤的侵袭和转移过程中，细胞必须降解并穿过由细胞外基质组成的组织屏障，然后通过缺损基质进行侵袭性生长和转移。由小GTP酶Rho家族调控的肌动蛋白动力学在细胞迁移过程中扮演了一个重要角色。细胞迁移的起始特征是肌动蛋白在细胞运动方向前沿聚合，并延伸为薄片状的伪足。已有研究证实，Rho家族成员Rac1具有调节肌动蛋白细丝在细胞外周聚集形成板层足板，同时参与了细胞恶性转化和诱导转移的过程。最近的研究证实Rac1对细胞在Ⅰ型胶原基质中侵袭有直接调控作用。研究发现，转染了活性RacI基因的非侵袭性哺乳动物上皮细胞T47D可诱导其产生侵袭I型胶原的能力。同样，衔接蛋白p130Crk相关底物(CAS)1/c-Crk Ⅱ(Crk)的过表达也可诱导在三维(3D)胶原基质中培养的Rac1依赖性COS-7细胞的侵袭。但是，有关Rac1促进细胞侵袭细胞外基质胶原屏障过程中胶原蛋白降解的机制仍不明确。 恶性肿瘤侵袭性生长与肿瘤周围基质蛋白降解及重塑(remodeling)是高度协调发生的事件。研究表明，基质金属蛋白酶(MMPs)可在多种癌组织中表达，且其表达的强弱与肿瘤的侵袭性和转移能力密切相关。细胞表面的蛋白降解活性可大大提高肿瘤细胞的侵袭和转移效能，基质金属蛋白酶2 (MMP2、Ⅳ型胶原酶、明胶酶A)是一种与细胞表面相连的可降解Ⅰ型胶原蛋白的MMP，其活化与膜型基质金属蛋白酶(MT-MMP)及金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)有密切关系。 我们研究的目的是为了进一步验证Rac1基因的表达对肿瘤细胞侵袭胶原蛋白基质的影响，并探讨Rac调控的肿瘤细胞侵袭Ⅰ型胶原蛋白组织屏障是否与启动MT1-MMP/MMP2蛋白降解级连反应有关。 方法：我们首先在体外研究外源Rac1基因表达对人纤维肉瘤HT1080细胞(以下简称HT1080细胞)侵袭胶原屏障的影响，将显性负调控突变体Rac1V12N17(HN)、结构激活型突变体Rac1V12(HV)或空载体(HW)转染HT1080细胞(以下分别简称HN、HV、HW细胞)，用G418筛选转染克隆，并扩增培养。用Western印迹分析检测外源性Rac1基因表达，实验细胞在含胶原蛋白凝胶的3D基质中培养，用得克萨斯红结合的鬼笔环肽染色显示细胞肌动蛋白。在用胶原蛋白凝胶覆盖滤膜的Transwell小室进行细胞穿膜侵袭实验，并观察二种蛋白酶抑制剂对上述细胞侵袭实验的影响。 然后，对3D胶原蛋白和纤维蛋白细胞培养体系中的细胞裂解液和培养液，采用明胶和胶原蛋白酶谱分析法观察Rac1对多种基质金属蛋白酶活化的影响;采用Western印迹法观察Rac1对基质金属蛋白酶2(MMP2)表达的影响。同时，我们还观察了不同蛋白酶抑制剂对Rac1介导的MMP2活化的影响。 我们采用Northern印迹法和Western印迹法检测在3D基质培养体系中，由于外源突变Rac1基因对HT1080细胞的MT1-MMP转录、表达及MT1-MMP的降解片段的影响；采用胶原蛋白降解实验观察转染后的HT1080细胞对胶原蛋白薄膜的降解能力的变化；采用穿膜(transwell)实验观察了特异性MMP2抑制剂对Rac1介导的HT1080细胞侵袭胶原蛋白屏障的影响。 结果：对分别转染HN突变体、HV突变体和HW空载体的HT1080细胞，用Western印迹法检测Rac1的表达。结果显示，HN和HV细胞均有内源性和外源性Racl表达，HW细胞仅见内源性Rac1表达。荧光显微镜观察，在3D胶原蛋白凝胶中培养的不同转染细胞呈现明显不同的细胞形态和排列结构。细胞侵袭实验显示HV细胞侵袭胶原屏障的能力大于HW细胞，而后者又强于HN细胞，这种差别在应用广谱MMPs抑制剂后消失，抑肽酶则无此影响。 在3D胶原蛋白凝胶培养体系中，与HW细胞比较，HV细胞的裂解液和培养液中均可观察到MMP2活化增强，而HN细胞则呈相反改变。在3D纤维蛋白凝胶培养体系中，HW和HN细胞裂解液和培养液中均未见活化的MMP2:而HV细胞则可观察到活化的MMP2。 广谱MMPs抑制剂SC68180可消除HV细胞裂解液和培养液中MMP2活化的增强，而另一种蛋白酶抑制剂，抑肽酶，则没有这种抑制效应。在3D胶原蛋白基质中，与HW细胞比较，HV细胞的MT1-MMP转录水平，以及蛋白表达和降解明显升高，而HN细胞三者均呈现下降改变。 与HW细胞比较，HV细胞降解胶原蛋白薄膜的能力明显增强；相反，HN细胞降解能力则减弱。HV细胞的MMP2活化增强可被其特异性抑制剂CTD所减弱，这种减弱效应呈浓度依赖性。胶原蛋白屏障侵袭实验也表明，TIMP2、FI(佛林蛋白酶抑制剂)和MMP2抑制剂CTD可显著减弱结构激活型Racl介导的HT1080细胞侵袭胶原蛋白屏障的增强作用。

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摘要

第一部分Rac1基因表达对人纤维肉瘤HT1080细胞侵袭胶原屏障的影响

第二部分Rac1表达调节Ⅰ型胶原蛋白基质中培养的人纤维肉瘤HT1080细胞MMP2的活化

第三部分Rac1调节Ⅰ型胶原蛋白诱导人纤维肉瘤HT1080细胞MMP2的活化需要MT1-MMP的活性

结论

综述Rho GTP酶和MMPs与肿瘤侵袭和转移关系研究进展

参考文献

致谢