MTBP通过增强MDM2调节e-钙黏蛋白的降解促进肝癌细胞的侵袭和迁移

摘要

目的:
　　肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)在目前癌症死亡率中排名第二位，手术切除是治疗肝癌的主要方法[1]。然而，多数患者从就诊到确诊为肝癌时已是中晚期，丧失了根治性手术治疗的机会，仅有不足20％的患者能及时进行根治性的手术切除。这主要是因为肝癌细胞的恶性程度高、发生转移早、呈快速浸润性生长所导致的。因此，研究调控肝癌侵袭转移的分子机制，寻找有效的防治靶点已成为肝癌治疗领域研究的一个关键性问题[2-3]。
　　最新研究证实MTBP可影响到肿瘤生长的许多方面，主要包括细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及耐药基因的表达等。研究发现MTBP在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，但其对肝细胞癌(HCC)的影响尚不清楚。我们首先发现MTBP蛋白高表达与远处转移、肝癌患者的预后不良情况相关。MTBP在转移性细胞系的表达与非转移性细胞系相比增加。与这些发现一致，MTBP的表达增强，促进肝癌细胞侵袭和转移在体外和在体内，而利用小干扰RNA片段沉默MTBP导致肝癌迁移和侵袭能力降低。在肿瘤进展中，肿瘤细胞获得的间充质标志物的表达和丢失的上皮标志物的表达，从而导致上皮-间质转化(EMT)和随后的肿瘤转移。E-钙粘蛋白(E-cadherin)的下调被证实是EMT的标志，并有研究报道与恶性上皮癌的发展有着密切的关系。我们前期通过基因芯片筛选在肝癌细胞中降低MTBP表达可导致E-cadherin表达升高。肝癌是一种侵袭和转移能力强的肿瘤，所以我们推测MTBP可能通过调控E-cadherin的表达从而影响肝癌细胞侵袭和转移。本研究拟先检测MTBP在肝癌组织中的表达并分析在肝癌患者中MTBP的表达与其生存率相关性;其次通过体外和体内研究明确MTBP调控E-cadherin表达对肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响;最后探讨MTBP调控E-cadherin的分子生物学机制。
　　方法:
　　1、通过运用RT-PCR、Western blot、免疫组化等方法检测120例肝癌组织及癌旁组织MTBP的表达水平，并运用Kaplan-Meier分析MTBP的表达与肝癌患者和复发肝癌患者的生存率的关系;
　　2、观察改变肝癌细胞中MTBP的表达，运用Western blot检测细胞中MTBP蛋白表达变化，同时利用划痕实验、Transwell和裸鼠成瘤实验观察肝癌细胞侵袭和转移能力的变化;
　　3、通过运用Western blot等方法检测改变肝癌细胞中MTBP的表达后E-cadherin蛋白的表达水平，以及肝癌组织及癌旁组织MTBP和E-cadherin蛋白的表达水平，并通过统计分析两者的相关性。
　　4、通过Western blot、免疫共沉淀、激光共聚焦确定MDM2和Ub的相互作用及MTBP如何参与MDM2的泛素化从而降低E-cadherin蛋白表达影响肝癌细胞的侵袭转移能力。
　　结果:
　　1、qRT-PCR、Western blot实验检测了120例肝癌组织样本和对应的癌旁组织MTBP表达，在肝癌组织中MTBP表达明显高于对应的癌旁组织。84(70.0％)例肝癌患者中肝癌组织中MTBP高表达，而只有12个(10％)癌旁组织高于癌组织高。我们通过免疫组化染色的结果也显示，在肿瘤组织中的MTBP蛋白的表达明显高于对应的癌旁组织。并通过Kaplan-Meier分析发现MTBP高表达患者的生存率明显低于MTBP低表达患者;
　　2、Western blot、划痕实验、Transwell和裸鼠成瘤等实验方法证实在肝癌细胞中，过表达肝癌细胞中MTBP的表达，可以促进肝癌细胞的侵袭迁移能力;干扰肝癌细胞中MTBP的表达，可以抑制肝癌细胞的侵袭和转移能力。
　　3、过表达肝癌细胞中MTBP的表达后E-cadherin蛋白明显下降，干扰肝癌细胞中MTBP的表达后E-cadherin蛋白明显升高。另外，通过Western blot实验检查发现肝癌组织及癌旁组织MTBP和E-cadherin蛋白的表达存在负相关性。
　　4、通过免疫共沉淀、激光共聚焦确定MDM2和Ub的相互作用，并证实MTBP可以通过调节MDM2的泛素化从而抑制E-cadherin蛋白的表达促进肝癌细胞的侵袭转移能力。
　　结论:
　　MTBP通过调节MDM2蛋白的泛素化降解从而抑制E-cadherin蛋白的表达从而促进肝癌侵袭和转移。为研究肝癌侵袭和转移的机制提供了新的理论基础，并将为肝癌的防治靶点提供一个新的研究方向。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

第1章 原发性肝癌组织中MTBP的表达与其生存率相关分析

引言

材料和方法

结果

1、在肝癌组织中RT-PCR及Western blot检测MTBP的表达情况

2、在肝癌组织中免疫组化检测MTBP的表达情况

3、MTBP表达和肝癌患者生存率的相关性分析

4、MTBP在多种肝癌细胞株中的表达情况

讨论

结论

第2章 MTBP调控E-cadherin表达及对肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响

材料与方法

1．材料

2 细胞培养

3．pcDNA3．1-MTBP质粒构建

4．构建shMTBP质粒

5．无内毒素质粒大量提取

6．Transwell侵袭实验

7．划痕实验

8 肝癌稳转细胞系构建

9 动物实验

10．HE染色

11．统计学分析

结果

1、pcDNA3．1-MTBP质粒构建

2、MTBP最佳干扰片段的筛选

3、观察改变肝癌细胞HepG2和Huh-7中MTBP的表达对肝癌细胞侵袭迁移的影响

4 Transwell侵袭实验检测改变MTBP表达对肝癌细胞迁移能力的影响

5．体内实验证实过表达MTBP表达对肝癌细胞转移能力的影响

6 在肝癌细胞中改变MTBP观察E-cadherin的表达情况

7 在肝癌组织中检测MTBP与E-cadherin的表达情况

8 MTBP和E-cadherin基因在肝癌组织中表达的关联性分析

讨论

结论

第3章 MTBP调控E-cadherin表达通过抑制MDM2泛素化的机制研究

材料和方法

1．材料

2 细胞培养

3．免疫共沉淀

4．Lipofectamine 2000法转染肝癌细胞

5．蛋白免疫印迹反应(Western blot)

6 蛋白酶体抑制实验

7 激光共聚焦免疫荧光实验

8．统计学分析

结果

1、在肝癌细胞中MTBP通过调控MDM2影响E-cadherin的表达

2．在肝癌细胞中MDM2蛋白经过泛素蛋白酶体降解

3．MTBP稳定NDM2通过影响MDM2的泛素化及降解

讨论

结论

全文总结

致谢

参考文献

综述 MTBP在肿瘤中的作用及研究进展