鸡败血支原体mga0553编码基因功能的初步鉴定

摘要

鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)是引发鸡慢性呼吸道疾病(Chronic respiratory disease，CRD)和火鸡传染性窦炎(Infectious sinusitis)的病原体，给家禽生产业带来巨大的经济损失。M. gallisepticum是介于细菌与病毒之间的一类基因组最小，并能自我繁殖的原核生物。其中强毒株Rlow全基因组序列长996422bp，含742个独立编码区(CDSs)。目前尚有150个保守的假定蛋白和123个假定蛋白的功能未被确定，尤其是对MG的致病性起着重要作用的膜相关蛋白及毒力因子。 本研究设计一对引物，上下游分别加入BamH I和Sal I限制性酶切位点，应用PCR方法将MG全基因组序列中的一个预测为未知蛋白的编码基因mga0553进行扩增。扩增产物连接pGEM-T easy载体，进行克隆和测序。运用DNAStar软件将目的基因预测蛋白氨基酸序列与Rlow株进行比较，分析发现：该蛋白为保守蛋白，R(F94)、S6、F36三株的MGA_0553仅有10个氨基酸发生了突变，但疏水区及α螺旋区分布未产生明显变化。将S6株的预测蛋白MGA_0553氨基酸序列提交SWISS—Prot数据库，分析结果显示：MGA_0553共包含376个氨基酸，带阴性电荷氨基酸(Asp+Glu)38个，阳性电荷氨基酸(Arg+Lys)44个；等电点为8.95，分子量为42kDa。采用DAS(Dense Alignment Surface)方法对该预测蛋白二级结构分析表明：在N38-55位是一个跨膜区。用SignalP 3.0进行信号肽分析，结果显示：该蛋白N1-50位可能是一个信号肽。综合分析结果表明：MGA_0553可能是MG的一种分泌蛋白成分。 将经BamH I、Sal，I双酶切的mga0553连接pET-32a(+)载体，转化BL21(DE31细菌的感受态细胞，经IPTG诱导，目的基因被低效率地以包涵体形式表达。SDS-PAGE分离目的蛋白条带，切胶免疫ICR小鼠制备特异性抗体，Western-blot检测诱导表达蛋白证实MGA 0553具有较强的免疫原性。以表达产物的抗血清为一抗， FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，通过免疫荧光染色技术检测S6、F36株菌体蛋白，结果发现：两株菌体细胞均呈现较强的绿色荧光。S6株菌体细胞在分别含有鼠抗MGA_0553和S6全菌抗血清的Frey’s液体培养基中进行生长抑制试验，结果显示：菌体细胞在含有抗MGA_0553血清的培养基中生长率为6×10<'-2>％，在含抗S6全菌血清的培养基中生长率为-2.2×10<'-4>％，结果表明抗MGA 0553血清对S6株菌体细胞的生长有抑制作用。 综上所述，mga0553基因是编码MG的一种膜相关蛋白，该蛋白的抗血清对MG的生长有抑制作用。其编码蛋白MGA_0553在MG定居、生长、繁殖和致病等生命活动的功能尚有待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

文献综述

第一章鸡败血支原体mga0553基因的克隆及序列分析

1材料与方法

2结果和分析

3讨论

第二章mga0553基因的原核表达及特异性抗体的制备

1材料与方法

2结果

3讨论

第三章MGA_0553蛋白功能的初步鉴定

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

附录

致 谢