兔GDF9的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究

摘要

根据NCBI上已发表的小鼠、人GDF9mRNA序列，分别在第1外显子和第2外显子处设计两对引物。采集母兔卵巢组织，利用Trizol法提取总RNA，然后用RT-PCR法进行cDNA扩增，获得了长度为289bp和299bp的两段目的片段。运用TA克隆法，将目的片段连接到PMDl9-T载体上，通过蓝白斑筛选和菌液PCR对重组质粒进行鉴定。测序后进行比对发现，目的片度长度为289bp的序列与人、猪的、牛的、小鼠的GDF9相对应序列，同源性分别为81％、78％、77％、74％。目的片段长度为299bp的序列与猪、人、牛、小鼠、山羊GDF9相对应序列同源性分别为86％、86％、86％、82％、87％。 用免疫组织化学方法对兔卵巢和睾丸中的GDF9蛋白进行定位，结果显示，原始卵泡中未见阳性表达，在初级卵泡中开始出现阳性表达，棕黄色阳性产物主要存在于卵母细胞膜上；次级卵泡中阳性表达增加，主要集中于卵母细胞胞质：在有腔卵泡中阳性表达位于卵母细胞膜和卵丘颗粒细胞，与次级卵泡相比表达有所下降。黄体中出现阳性表达。兔睾丸中GDF9蛋白呈阳性表达，棕黄色阳性表达产物主要存在于初级精母细胞和圆形精子细胞。精原细胞、支持细胞及成熟精子中呈阴性表达。 采集公兔的下丘脑、垂体、睾丸、附睾和母兔的下丘脑、垂体、卵巢、子宫组织，利用Trizol法提取总RNA。RT-PCR法对其进行组织表达谱研究，发现在上述组织中都有GDF9mRNA的表达，表明GDF9mRNA的表达在兔上不具有特异性。 利用实时荧光定量PCR法测定公兔的下丘脑、垂体、睾丸、附睾和母兔的下丘脑、垂体、卵巢、子宫中GDF9mRNA相对表达丰度变化。结果表明：在公兔的下丘脑-垂体-腺轴中，以公兔睾丸为校正样本表达量为1，下丘脑、垂体中的GDF9mRNA表达量分别是它的0.1354倍、0.4394倍，附睾中GDF9mRNA的表达量明显高于上述三种组织为睾丸的3.0543倍。在母兔的下丘脑．垂体．性腺轴中，以母兔垂体为校正样本表达量为l，卵巢表达量最多，为垂体的13.7271倍，下丘脑中的表达量为垂体的5.035倍，子宫表达量低于下丘脑为垂体的2.0528倍。各组织间GDF9mRNA表达水平差异显著。

目录

声明

摘要

前言

1、实验材料

1.1实验动物

1.2质粒、菌株

1.3药品及试剂盒

1.4主要仪器

1.5溶液配制及培养基

2.实验方法

2.1 GDF9基因部分cDNA的克隆与序列分析

2.1.1器皿的处理

2.1.2样品的采集

2.1.3总RNA的提取

2.1.4总RNA的DNAse处理

2.1.5 RT-PCR

2.1.6 PCR产物的克隆及鉴定

2.1.7核酸序列测定与分析

2.2GDF9mRNA组织表达谱

2.3 GDF9在兔性腺中的定位

2.4 GDF9 mRNA表达实时荧光定量检测

3.结果与分析

3.1GDF9 cDNA的克隆与序列分析

3.2.GDF9mRNA的组织表达谱

3.3GDF9蛋白在腺中的定位

3.4 GDF9mRNA表达实时荧光定量检测

4.讨论

5.结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文