联合转染反义寡核苷酸治疗胰腺癌和MRI动态观测的实验研究

摘要

本文采用K-ras突变的反义寡核苷酸和胰岛素样生长因子I型受体(IGR—IR)反义寡核苷酸对胰腺癌进行体外和体内治疗实验，以探讨这两种反义基因的联合治疗效果，实验中采用了大型高场强MRI并首次引入了显微镜线圈对荷瘤鼠进行了动态观测并对其影像学表现进行了深入探讨。 一、PCR-SSP法检测人胰腺癌细胞株Patu8988K-Fas基因点突变及其形式。 1．目的： 通过PCR-SSP法检测人胰腺癌Patu8988细胞株K—rfl$基因第12密码子的点突变及其形式。 2．材料和方法： 提取对数生长期的Patu8988细胞的基因组DNA。以基因组DNA为模板，分别加入针对K-ras第12密码子的三种主要突变方式设计的PCR上游引物R1、R2、R3和共同的下游引物R4，在TaqDNA聚合酶作用下扩增相应片段。经12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外透射分析仪下观察并拍照。 3．结果： 在R2-R4(GTT突变)配对上出现明亮电泳条带，分子量约为88bp，扩增片段分子量大小与设计相符合，表明人胰腺癌细胞株Patu8988存在K-ras基因第12密码子点突变，且突变形式为GTT。 4．结论： PCR-SSP法测出了人胰腺癌Patu8988K-ras基因的12密码子的突变形式为GTT。同时证明PCR-SSP法简单、快速、准确。 二、联合应用K—ras和IGF-IRff．义寡核苷酸3,-1人胰腺癌细胞株Patu8988调节作用的影响。 1．目的： 采用针对K—ras点突变的反义寡核苷酸和IGF．IR反义寡核苷酸联合应用对人胰腺癌细胞株Patu8988进行了体外治疗试验，对联合应用反义寡核苷酸的效果进行评价，并对其机制进行探讨。 2．材料和方法： 根据Patu8988细胞株K—ras第12密码子点突变形式GTT，设计出与之互补反义寡核苷酸(K-ras-mut)，同时根据K-rascDNA帽区序列设计与K-ras基因帽区反义寡核苷酸(K-ras-cap)。IGF．IR的反义寡核苷酸序列选用经较多科研单位证实效果较好的序列(IGF．IR)。 采用MTT法确定反义寡核苷酸的最佳有效剂量、筛选K-ras-mut和K-ras-cap中抑制效果优者，并选择反义寡核苷酸作用最佳时间点。通过倒置相差显微镜和细胞集落试验进一步观察反义寡核苷酸对细胞抑制的效果。 通过流式细胞仪检测K-ras蛋白和IGF．IR蛋白表达率以及细胞凋亡率，RT-PCR检测K-ras和IGF．IRmRNA表达。并采用电镜观察用药后的细胞器微观变化。 3．结果： MTT检测结果表明采用16μg／ml的药物浓度对肿瘤细胞产生较好的抑制作用，K-ras-mutASODN抑制效果优于K-ras-capASODN，药物抑制作用最佳时间点为48h。倒置相差显微镜观察和细胞集落试验都证实联合用药对细胞生长产生明显抑制作用。蛋白和mRNA检测结果证实反义寡核苷酸均可以抑制其相应的蛋白和mRNA表达，联合用药组的凋亡率最高。电镜从微观影像角度证实联合用药导致细胞凋亡。 4．结论： 联合应用反义寡核苷酸可以对体外培养的胰腺癌细胞产生明显的抑制作用，其效果明显好于单独用药。同时证实联合用药可以对体外培养胰腺癌细胞的K-rasmRNA、IGF．IRmRNA和K-ras蛋白、IGF．IR蛋白均产生明显抑制作用，并通过导致细胞凋亡和抑制细胞增殖信号传导等机理对胰腺癌细胞的生长产生抑制作用。 三、人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型的MRI表现和病理对照研究。 1．目的： 探讨人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤MR]检查技术及其影像表现的病理机制。 2．材料和方法： 建立人胰腺癌Patu8988细胞株裸鼠皮下移植瘤模型20只。于细胞接种后2、4、6、7、8周随机抽取4只荷瘤鼠，大体测量、MR]测量和病理解剖测量肿瘤体积；荷瘤鼠先行MR]平扫，腹腔注射钆贝葡胺4、8、12、16、20min后行MR]连续增强扫描，观测肿瘤影像学特征和周围组织情况；测量平扫和增强后各时相肿瘤和右侧颈后部肌肉的信号强度，并计算肿瘤的CNR和强化率。MRI检查后行病理检查，并与MR]表现进行对照分析。 3．结果： 肿瘤接种成功率为100％，MR]测量肿瘤体积与病理检查结果更相近(P值大于0．05)。MR]可根据肿瘤内部的信号表现判断肿瘤内部的病理表现，同时还可显示肿瘤向周围组织的侵袭情况。增强后各时相肿瘤的信号强度、CNR均高于平扫(Dunnett—t检验，P值均<0．05)，增强后各时相肿瘤的强化率和CNR之间无统计学差异(方差分析，P值均大于0．05)。 4．结论： (1)采用MR]、显微镜线圈和增强检查相结合可以清晰地显示人胰腺癌Patu8988细胞株裸鼠皮下移植瘤及其对周围组织侵蚀表现。(2)腹腔注射造影剂4分钟后可以使肿瘤明显强化，并可提供更多的生物学信息，证实腹腔注射是荷瘤鼠MR]增强扫描较可靠的方法。(3)通过对移植瘤MR]表现和病理表现进行分析，明确MR]表现均有其对应的病理学机制，对深入理解动物模型的MR]表现奠定了理论基础。 四、动态帜1分析联合应用K—ras和l6F-IR反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞裸鼠移植瘤的作用。 1．目的： 通过对荷瘤鼠模型进行联合转染反义寡核苷酸并采用MRI、Microscopy47线圈结合增强检查对对荷瘤鼠肿瘤生长进行动态观测，同时对影响肿瘤生长的相关因素进行分析，以探讨联合用药对皮下移植瘤的治疗效果以及MRI动态观测肿瘤动物模型的价值。 2．材料和方法： 建立人胰腺癌细胞株Patu8988裸鼠移植瘤模型，取16只随机分为K-ras-mutASODN组、IGF．IRASODN组、联合用药组和对照组，接种1周后用药。采用MR／、Microscopy47线圈结合增强检查动态观察反义寡核苷酸对肿瘤生长抑制作用。至肿瘤生长第7周处死裸鼠，取肿瘤病理检查并对照MRI影像表现进行分析。 取裸鼠移植瘤模型20只，随机分为K-ras-mutASODN组、IGF．IRASODN组、联合用药组、RAN组和对照组，于肿瘤接种7周后用药。用药结束后处死裸鼠，取出肿瘤，分别进行常规HE染色病理检查、免疫组化蛋白检测、RT-PCR检测mRNA、流式细胞仪凋亡检测和电镜观察。 3．结果： 通过MR／观测，结果显示单独用药和联合用药均能够对肿瘤的生长产生抑制作用，联合用药效果明显好于单独用药组。同时MR／还可以充分评价裸鼠移植瘤模型的较为全面的情况。其影像表现与病理分析结果基本一致。 病理结果显示联合用药在肿瘤成长较大后仍可以明显抑制甚至杀伤肿瘤细胞。联合用药可以对K—ras蛋白、IGF．IR蛋白、K—rasmRNA和IGF．IRmRNA均产生明显抑制作用，明显提高肿瘤细胞的凋亡率。电镜显示联合用药可以清晰地观察到凋亡细胞。 4．结论： MRI可以充分观察药物对裸鼠移植瘤模型的作用，并对生物学情况做较为全面评价。联合用药可以对裸鼠移植瘤胰腺癌细胞的相关的mRNA和蛋白均产生明显抑制作用，并通过导致细胞凋亡等机理对胰腺癌生长产生抑制作用，证实联合用药对胰腺癌肿瘤抑制效果明显好于单独用药。

目录

文摘

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引言

体外实验流程图

第一部分PCR-SSP法检测人胰腺癌细胞株Patu8988K-ras基因点突变及其形式

第二部分：联合应用K-ras和IGF-ⅠR反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞株Patu8988调节作用的影响

第三部分人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型的MRI表现和病理对照研究

第四部分：动态MRI分析联合应用K-ras和IGF-ⅠR反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞裸鼠移植瘤的作用

结论

缩略词表

三年期间学术成果

致谢