人LIGHT基因转染细胞的构建及鼠抗人LIGHT单克隆抗体的研制

摘要

人LIGHT(TNFSFl4)属于TNF超家族成员，为Ⅱ型跨膜糖蛋白，编码240个氨基酸。原位杂交实验发现人LIGHT定位于19p13．3，与CD27L，4．1BBL，c3相邻。LIGHT与LTβ和FasL分别有34％和31％的同源性，而且LIGHT与LTαβ异源三聚体结合同一个受体LTBR，与LTα结合同一个受体HVEM，与FasL结合同一个受体DeR3。LIGHT主要表达在活化T细胞和未成熟DC，其mRNA在脾脏细胞、活化的PBL、CD8+肿瘤浸润淋巴细胞、粒细胞和单核细胞均有高表达，但不表达于胸腺组织。一些研究结果表明，LIGHT可以促进肿瘤细胞凋亡，也可以促进淋巴细胞细胞活化，这都依赖于靶细胞表达的受体。研究显示，LIGHT是不依赖于CD28的可诱导型表达的共刺激分子，可有效地协同CD3信号促进T细胞的增殖，同时它也可以促进DC成熟，提高DC对抗原的提呈能力；体外实验发现，可溶性LIGHT分子可使一些恶性肿瘤生长减缓甚至可以诱导细胞凋亡。因此，可溶性和膜型LIGHT与其受体形成的信号网络在免疫应答和抗肿瘤免疫中有重要的作用。 1人LIGHT基因的克隆 采用RT-PCR的方法，从活化T细胞中克隆得到了人LIGHTcDNA，将其装入克隆载体pMDl8-T，得重组载体pMDl8-T／LIGHT，酶切、PCR和测序鉴定正确。由此，为人LIGHT基因转染细胞的构建奠定了物质基础。 2人LIGHT基因转染细胞的构建 通过基因克隆技术，将人LIGHT全长的cDNA片段插入逆转录病毒载体pEGZ-HA-Term。测序正确后，通过脂质体转染技术将重组表达载体(pEGZ-HA．Term／LIGHT)与辅助病毒载体共转染包装细胞293T，用其培养上清感染L929细胞72h后，经Zeocin筛选出稳定表达LIGHT分子的L929细胞株(L929／LIGHT)。经体外长期传代和液氮反复冻存复苏，基因转染细胞生长良好，LIGHT的表达稳定在95％以上。 3L929／LIGHT基因转染细胞对T细胞的共刺激作用 将人外周血T细胞加入包被有抗人CD3激发型单抗的24孔或96孔板中，丝裂霉素处理的基因转染细胞L929／LIGHT为刺激细胞，L929／mock为对照细胞，共培养3天。MTT法的分析结果显示，人CD3激发型单抗联合L929／LIGHT组与实验对照组相比能显著地促进T细胞增殖。ELISA法检测培养上清细胞因子的分泌，结果显示基因转染细胞L929／LIGHT能显著促进人外周血T细胞分泌IFN-γ。 4分泌鼠抗人LIGHT单抗的杂交瘤细胞株的制备 用已建立的基因转染细胞为免疫原，免疫BALB／c小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓细胞SP2／0进行细胞融合，以上述基因转染细胞为阳性筛选细胞，以转质粒的对照细胞L929／mock作为阴性对照细胞，经免疫荧光标记分析及抗体分泌阳性孔内杂交瘤细胞的反复筛选，并经多次克隆化培养，最终获得4株持续、稳定分泌鼠抗人LIGHT单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2G4、2A11、1F12、1D1l。经快速定性试纸法分析鉴定，2G4重链为IgG2a；其它均为IgGl；轻链均为K。经体外连续培养半年以上，液氮冻存后复苏，细胞的生长状态良好，分泌抗体的性能稳定。 继而采用本室建立的腹水诱生和纯化方案，腹水形成阳性率为95％以上，腹水的产量平均为5．0ml／只小鼠。经ProteinG亲和层析柱分离纯化，腹水型单抗纯化后蛋白含量在0．8～10mg／ml之间。纯化后单抗的效价为1：1000以上，抗体蛋白用于间接免疫荧光分析的用量为0．2～2μg/1×10°细胞。 5鼠抗人LIGHT单克隆抗体对LIGHT膜分子的识别 westemblot方法检测四株单抗与L929／LIGHT细胞膜上的LIGHT分子结合情况，结果显示四株单抗均可以在蛋白水平上与LIGHT分子结合。利用已纯化的单抗间接免疫荧光法检测肿瘤细胞株上LIGHT分子的表达，结果表明大部分肿瘤细胞株不表达，而乳腺癌、肺癌的一些细胞株表达LIGHT分子。 6四株抗LIGHT单克隆抗体识别不同的抗原位点 为了检测四株单抗识别LIGHT分子的表位，分别用生物素标记四株单抗，两两比较结合位点的异同。流式细胞术检测结果发现四株单抗识别抗原位点各不相同。这为研究LIGHT的生物学特性和制备LIGHTELISA试制盒奠定了物质基础。 7T细胞和DCLIGHT分子表达的生物学特性分析 使用己研制的抗人LIGHT单克隆抗体和流式细胞术检测LIGHT分子在T细胞活化和DC分化过程中的表达显示，LIGHT在T细胞活化过程中呈暂时性表达，而只有未成熟单核细胞来源的DC(Mo-DC)高表达LIGHT分子，随着Mo-DC的体外诱导成熟而表达下调。 8两株单克隆抗体2G4、2All阻断LIGHT信号介导的协同刺激作用 在基因转染细胞协同激发型CD3mAb刺激T细胞增殖实验基础上，加入2G4、2All单抗，结果显示这两株单克隆抗体可部分阻断T细胞经由基因转染细胞协同CD3mAb刺激的增殖。由此提示2G4、2AllmAb可能为阻断型单克隆抗体，为进一步研究LIGHT信号介导的生物学功能奠定了基础。 总之，我们在构建L929／LIGHT基因转染细胞的基础上，成功研制了四株识别不同抗原位点的抗人LIGHT单克隆抗体。利用基因转染细胞和单抗初步研究了LIGHT分子在T细胞上的生物学功能，同时发现LIGHT分子在T细胞活化和DC成熟过程中的暂时性表达的生物学特征。

目录

文摘

英文文摘

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研究背景

第一部分人LIGHT基因转染细胞的构建及其对T细胞共刺激作用的研究

第二部分鼠抗人LIGHT单克隆抗体的研制及生物学特性的研究

结论与展望

研究生学习期间已发表及待发表的论文

缩写词表

LIGHT的生物学特征及疾病相关的研究

本研究所获得的基金资助

致 谢