生长因子在肌腱损伤愈合早期中的表达变化及转基因治疗肌腱损伤的初步研究

摘要

目的： (1)检测结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子β(TGF-β)、类胰岛素生长因子1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF-B)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在肌腱损伤愈合早期的mRNA水平变化规律和TGF-β，bFGF和IGF-1在蛋白水平的表达变化。 (2)探索微量注射法以不同转基因载体转基因至损伤肌腱的转基因效率、分布和组织反应。 (3)比较腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)和脂质体-质粒(liposome-plasmid)三种转基因载体在肌腱中的基因转染效率并观测腺相关病毒载体介导碱性成纤维细因子(bFGF)基因在肌腱愈合过程中表达。 (4)探讨微小RNA导入肌腱细胞和损伤肌腱沉默转化生长因子(TGFβ)基因的作用及对I型胶原、III型胶原和CTGF基因表达的影响。 方法： (1)在鸡趾的掌面掌趾关节与近节趾间关节间行Bruner切口，游离出趾深屈肌腱(FDP)，并在趾半屈曲位时用锐刀将其从掌侧横形做完全切断，然后用5-0无创缝线做改良Kessler法缝合修复肌腱。在术后第3、5、7、9、14和21天分别取肌腱，做TGF-β，bFGF和IGF-1免疫组化染色，观测其表达变化和分布。通过实时PCR方法检测CTGF、TGF-β、VEGF、IGF-1、PDGF-B和bFGF基因的mRNA水平在术后第3、9、14和21天四个时间点表达变化。 (2)用微量注射器将10微升携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的pCMV-EGFP、pCAGGS-EGFP、AAV2-EGFP和Ad5-EGFP载体直接注射入18只鸡的48根横断伤的趾屈肌腱近侧断端截面上取两点注射。在术后第3、7、14、21天分别取肌腱，进行冰冻切片后在荧光显微镜下观察肌腱内的EGFP表达量及分布，并将肌腱切片作HE染色后观察各不同载体在肌腱中引起的炎症反应。另24根肌腱不作手术作为对照。 (3)用微量注射器将携带增强绿色荧光蛋白报告基因的pCMV-EGFP、AAV2-EGFP和Ad5-EGFP注射入鸡的正常趾深屈肌腱中，术后第3、7、14和21天分别取肌腱进行冰冻切片，荧光显微镜观测肌腱内EGFP的表达。将携带有bFGF基因的AAV2-bFGF病毒颗粒注入完全切断的鸡的趾深屈肌腱，术后的第2、3和4周获取注射AAV2-bFGF实验组的肌腱及对照组肌腱做免疫组化染色。 (4)针对鸡TGFβ1基因的mRNA序列，设计并合成4对miRNA TGFβ1 DNA序列和一对不编码序列，分别插入至miRNA质粒载体(pcDNA6．2)中，获得5个miRNA TGFβ1质粒载体，其分别命名为miRNA＃1、＃2、＃3、＃4和阴性对照。将不同的miRNA载体转染培养的肌腱细胞，用荧光显微镜观测载体携带的增强绿色荧光蛋白报告基因在肌腱细胞的表达，并使用流式细胞仪评价转基因的效率。采用实时PCR技术检测并分析miRNA导入肌腱细胞后TGFβ1、I、III型胶原和CTGF基因表达变化。选用抑制TGFβ1表达最明显的miRNA＃1载体转染活体损伤肌腱。在转基因治疗肌腱一周和六周后，检测TGF-β1、I、III型胶原和CTGF基因在体内损伤肌腱中的表达。 结果： (1)在肌腱损伤愈合早期CTGF、TGF-β基因mRNA表达水平较高，其中TGF-βmRNA在肌腱损伤后呈增高的趋势；VEGF和IGF-1基因mRNA表达水平次之；bFGF和PDGF-B基因mRNA在肌腱损伤后表达水平较低，且bFGF基因mRNA呈逐渐下降的趋势。TGF-β，bFGF和IGF-1免疫组化也显示相同结果。 (2)荧光显微镜下观测发现，注射4种转基因载体的肌腱，转染3天后即可见肌腱内有增强绿色荧光蛋白表达；在第7天时表达最明显；第14天时，各组表达增强绿色荧光蛋白表达量下降；21天时很少有表达增强绿色荧光蛋白的细胞。用微量注射器在腱段两点注射能保证近损伤肌腱内转染细胞均匀分布。注射AAV2-EGFP和Ad5-EGFP的肌腱的增强绿色荧光蛋白明显多于质粒载体的增强绿色荧光蛋白，而AAV2-EGFP和Ad5-EGFP两组间无明显差异。HE染色发现质粒载体和Ad5-EGFP致肌腱的组织反应较重，可见较多炎症细胞浸润，以淋巴细胞和中性粒细胞为主。注射AAV2-EGFP的肌腱炎症反应较轻。 (3)荧光显微镜下可见三种不同的载体在肌腱内均表达EGFP：转染3天后即可见肌腱内有EGFP表达；在第7天时表达最明显；第14天时，各组EGFP的表达下降；21天时很少有表达EGFP细胞。在同期的时间点，注射AAV2-EGFP和Ad5-EGFP的肌腱内EGFP表达明显强于质粒载体，而AAV2-EGFP和Ad5-EGFP两组之间无较大区别。术后的第2、3和4周免疫组化染色结果发现：相比于正常和对照组肌腱，注射AAV2-bFGF的肌腱表达很强的bFGF。 (4)体外细胞培养中荧光显微镜观察到肌腱细胞有EGFP表达，流式细胞仪检测基因转染效率为20～25％。与阴性对照细胞组相比，实时PCR结果分析显示：miRNA＃1和＃2质粒载体治疗的细胞组TGFβ1基因表达分别下降了68％和43％；在miRNA＃1治疗的细胞组，III型胶原和CTGF基因表达分别也下降70％和68％，这些变化在统计学上有显著性。使用miRNA＃1干扰质粒转基因至体内损伤肌腱结果显示：术后一周，TGFβ1基因表达下降了67％，而I、III型胶原和CTGF基因表达没有变化；术后六周，TGFβ1和III型胶原基因表达分别下降了56％和58％，变化在统计学上有显著性。 结论： (1)在肌腱损伤愈合的早期(3周内)TGF-β基因表达水平较高，呈逐渐升高趋势；CTGF，VEGF，and IGF-1表达次之；bFGF基因表达水平较低且逐渐降低；PDGF-B表达较低。 (2)用微量注射器在腱段两点注射转基因载体能转染近损伤处的整个肌腱段的细胞。在研究的四种基因治疗方法中，AAV2和Ad5在在损伤肌腱中的转基因效率最强，在转基因后第7天表达最明显，而且AAV2引起的肌腱组织反应最轻。提示AAV2载体比Ad5和质粒载体有利于作为转基因治疗肌腱损伤的载体，微量注射载体是转基因至损伤肌腱的合适方法。 (3)Ad5和AAV2载体的基因转染效率高于脂质体-质粒载体，AAV2携带的外源性bFGF基因肌腱细胞内较强表达，提示我们将来在体内转基因到肌腱的研究中能够选择腺病毒和腺相关病毒载体作为运载基因的工具。 (4)miRNA导入肌腱细胞后TGFβ1、III型胶原和CTGF基因表达显著下降。导入miRNA至活体损伤肌腱后一周，TGFβ1基因表达显著下降；术后六周，TGFβ1和III型胶原基因表达显著下降。本研究提示miRNA能有效沉默肌腱TGFβ基因表达，可望成为减少损伤肌腱粘连的方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

研究背景

第一部分生长因子在肌腱损伤愈合早期中的表达变化

1材料与方法

1.1实验动物

1.2肌腱手术

1.3肌腱标本获取

1.4实时PCR方法检测生长因子mRNA表达变化

1.5 IGF-1、TGF-β和bFGF的免疫组化染色

1.6肌腱的HE染色

1.7生长因子表达水平的统计学分析

2结 果

2.1内参GAPDH普通PCR结果(示意)

2.2实时PCR扩增曲线、熔解曲线和PCR产物电泳图随机选取示意

2.3在同一时间点各生长因子的mRNA水平在肌腱愈合早期的表达

2.4生长因子在肌腱愈合早期的不同时间点表达

2.5生长因子免疫组化染色

2.6肌腱在损伤后不同时间点的炎症反应

3讨论

参考文献

第二部分 注射不同载体转基因至损伤肌腱的效率、分布和组织反应

1材料与方法

1.1转基因载体及相关试剂

1.2实验动物及分组

1.3肌腱标本的获取

1.4转基因效率的荧光显微镜观察

1.5转基因载体引起肌腱组织反应观察

1.6肌腱组织反应细胞密度的统计学分析

2结 果

2.1四种基因治疗方法在损伤肌腱中的转基因效率

2.2四种基因治疗方法在损伤肌腱中引起的组织反应

2.3肌腱组织反应细胞密度分析

3讨论

参考文献

第三部分不同载体在肌腱中转基因效率及AAV2介导bFGF基因在愈合肌腱中表达的研究

1材料与方法

1.1载体及相关试剂

1.2实验动物

1.3动物手术及分组

1.4肌腱标本的获取

1.5 GFP荧光显微镜观察

1.6 bFGF免疫组化染色

2结 果

2.1荧光显微镜观测肌腱细胞表达EGFP

2.2鸡趾深屈肌腱免疫组织化学染色

3讨论

参考文献

第四部分基因治疗导入微小RNA沉默肌腱细胞转化生长因子基因的体外研究和体内应用

1材料与方法

1.1 miRNA TGF β1干扰表达载体的设计及干扰质粒的制备

1.2肌腱细胞原代培养

1.3基因转染

1.4实时PCR检测肌腱细胞TGF β1，Ⅰ、Ⅲ型胶原和CTGF基因表达

1.5导入miRNAs至体内损伤肌腱及对损伤肌腱基因表达作用的体内实验

1.6 TGF β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和CTGF基因表达的统计学分析

2结果

2.1导入miRNA沉默肌腱细胞TGF β1基因效果及对Ⅰ、Ⅲ型胶原和CTGF基因表达影响

2.2导入miRNA沉默损伤肌腱TGF β1基因效果及对Ⅰ、Ⅲ型胶原和CTGF基因表达影响

3讨论

参考文献

结 语

综述：肌腱损伤与修复

博士研究生期间发表和待发表的论文及学术交流

附 录

致谢