MicroRNA-221及EphA2在神经胶质瘤细胞系U251中关于生长、凋亡等方面作用的研究

摘要

目的： 探索microRNA-221及EphA2在神经胶质瘤细胞系U251中的表达情况及研究两者在U251细胞增殖、凋亡等方面所起的作用。寻找诊断胶质瘤及潜在应用于胶质瘤基因治疗的新方法。 方法： 第一部分： 1、通过查阅文献得知，microRNA-221(miRNA-221)在多个神经胶质瘤标本及多种胶质瘤细胞系中的表达显著高于正常脑组织标本。由此推断miRNA-221在胶质瘤形成过程中可能是癌基因。 2、体外化学合成针对miRNA-221的2’-甲氧修饰的反义寡核苷酸单链和非特异性阴性对照单链miRNA。 3、采用脂质体转染的方法将合成的miRNA-221的反义链转染入胶质瘤U251细胞系中，用CCK-8及AnnexinV/PI试剂盒检测细胞的增殖和凋亡情况。 第二部分： 1、RT-PCR检测U251细胞和U87细胞系及正常脑组织标本中EphA2基因的表达情况； 2、体外合成靶向EphA2基因的特异性siRNA和非特异性阴性对照siRNA，采用脂质体转染的方法将siRNA导入胶质瘤U251细胞系中，并用Real-timePCR和Western blot方法检测siRNA-EphA2对U251细胞中EphA2表达的影响； 3、观察特异性siRNA转入U251细胞后是否引起胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的降低及是否可以诱导细胞凋亡。以此来研究EphA2基因在胶质瘤的生长和侵袭转移方面的作用。 结果： 第一部分：用脂质体方法把miRNA-221的反义链转染入U251细胞后。 1、用CCK-8检测到实验组胶质瘤细胞的生长速度与阴性对照组相比受到了明显的抑制。 2、流式细胞仪检测到转染对照组miRNA细胞的凋亡率为3.07％，转染miRNA-221反义序列组的细胞凋亡率为4.12％，三次重复实验均表明两组之间细胞凋亡率无统计学差异。 第二部分： 1、通过基因水平检测，EphA2基因在胶质瘤U251和U87细胞中的表达水平明显高于正常脑组织； 2、用Western blot方法检测转染siRNA-EphA2后U251细胞中EphA2蛋白表达量，转染10 nM时，蛋白的抑制率与阴性对照组相比达到50％，50 nM时蛋白的抑制率为70％；用Real-time PCR检测转染10 nM、50 nM siRNA-EphA2后EphA2 mRNA的表达水平与阴性对照组相比分别降低了45％、70％； 3、流式细胞仪检测转染阴性对照组细胞的凋亡率为6.56％，转染siRNA-EphA2组的凋亡率为28.21％，凋亡率的差别有显著的统计学意义； 4、以50 nM浓度转染U251细胞，实验组细胞的生长速度及迁移、侵袭能力较阴性对照组明显下降。 结论： 1、MiRNA-221在胶质瘤细胞U251中，可以促进胶质瘤细胞的增殖。但在抑制肿瘤细胞凋亡方面没有显著的作用。 2、EphA2基因在正常脑组织标本中的表达明显低于两种胶质瘤细胞系。 3、应用RNA干扰技术可以有效抑制靶基因的表达，在转染特异siRNA后出现肿瘤细胞的生长阻滞，诱导凋亡，并出现肿瘤细胞低迁移和低侵袭的现象。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照缩略词表

声明

引 言

第一部分靶向反义单链沉默microRNA-221抑制胶质瘤生长的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分研究EphA2在神经胶质瘤U251细胞中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述：MicroRNA在神经胶质瘤中的研究进展

附图

攻读学位期间公开发表的论文

致谢