血小板Sema4D钙调蛋白结合基序的鉴定及其调控Sema4D切割的机制研究

摘要

神经导向因子Semaphorin4D(Sema4D；CD100)是首先在T淋巴细胞上发现的具有促进B细胞分化功能的I型跨膜糖蛋白，进一步的研究表明Sema4D通过其受体CD72/Plexin-B1/Plexin-B2参与免疫反应、神经生长、肿瘤血管新生、血栓形成以及骨生长等。Sema4D可以被金属蛋白酶17（ADAM17）切割，产生具有生物活性的可溶性蛋白。然而，Sema4D切割和可溶性Sema4D生成的调控机制所知甚少。目前认为可能有两种机制：第一，切割酶的表达和活性的增强可导致Sema4D的切割；第二，“底物主导”的切割机制，Sema4D构象改变后可以更接近切割酶，导致自身被切割。本论文根据Sema4D的切割可能是“底物主导”（substrate-oriented）的设想，系统分析了Sema4D氨基酸序列和分子结构，发现Sema4D的胞内段近膜区含有一段18个氨基酸组成的序列（Arg762-Lys779），这段序列具有保守的极性氨基酸残基，并且可以形成两亲性α螺旋，这是钙调蛋白结合的特征性结构。利用免疫共沉淀技术，我们证明在静息血小板中Sema4D分子与钙调蛋白结合，血小板活化后Sema4D-钙调蛋白复合体解离,提示钙调蛋白参与Sema4D切割调控。
　　为了探究Sema4D是否通过这段18个氨基酸组成的基序与钙调蛋白结合，我们合成了 Sema4D钙调蛋白结合基序的多肽，命名为Sema4D钙调蛋白结合肽（Calmodulin-binding peptide of Sema4D, CBPS），以这段多肽作为一种工具来进一步研究 Sema4D-钙调蛋白结合的分子机制，以及阻断结合所产生的生物学效应。利用蛋白标记、结合实验证明CBPS可与天然和重组Sema4D结合，其解离常数为165±40 nM，这与血小板表面其他受体与钙调蛋白的解离常数类似。将CBPS多肽作为工具来研究Sema4D切割，首先要明确CBPS是否可以穿过细胞膜，利用流式细胞仪以及共聚焦显微镜技术，我们证实 CBPS多肽可穿过细胞膜，存在于血小板内部。功能研究证明5μM CBPS处理血小板30秒即可诱导血小板Sema4D-钙调蛋白复合体的解离，同时，我们观察了CBPS对Sema4D分子切割的影响，结果显示，CBPS诱导Sema4D切割并且呈现浓度、时间依赖性。而且，CBPS诱导的这种切割不依赖于血小板活化和ADAM17的活性增加。
　　钙调蛋白在细胞内以游离形式或者结合形式存在，两种形式之间保持一动态平衡。CBPS进入血小板内部，与钙调蛋白结合，打破动态平衡，导致一些结合形式的钙调蛋白转变为游离形式，诱导Sema4D分子切割，同时我们也检测到CBPS可以诱导其他膜蛋白受体（如GPIbα、GPVI）切割，然而，我们的结果显示，5μM的CBPS就可以诱导Sema4D分子切割，而诱导GPVI和GPIbα切割则分别需要10μM和20μM，说明CBPS对三种分子切割的敏感性不同，这也提示我们钙调蛋白调控切割机制的普遍性与复杂性共存。利用钙调蛋白抑制剂 W7进一步证明了钙调蛋白调控Sema4D切割这一生物现象。
　　以上我们是采用血小板为模型进行钙调蛋白调控切割的研究，我们认为这种现象也存在于其他细胞中，而且之前有文献表明在淋巴细胞中，Sema4D自发切割产生可溶性片段。因此，我们通过基因突变方法，构建了 Sema4D突变质粒，删除Sema4D分子钙调蛋白结合基序，从而阻止Sema4D与钙调蛋白结合。将质粒转染中国仓鼠卵巢细胞，发现当删除钙调蛋白结合基序后Sema4D分子的自发切割明显增加。这一结果支持之前报道的自发切割现象。
　　综上所述，我们的研究证明胞内钙调蛋白与Sema4D的结合是血小板Sema4D分子切割的调控机制之一，其结果支持Sema4D切割的“底物主导”机制的设想。由于Sema4D在多种细胞表达并参与多种病理生理过程，Sema4D切割的胞内调控机制的发现，将为相关理论和相关疾病过程提供理论支持和实验依据。

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前 言

材料与方法

1 材料

2. 方法

结 果

1．血小板Sema4D钙调蛋白结合序列的鉴定

2． 钙调蛋白参与Sema4D分子切割调控的机制研究

讨 论

结 论

参考文献

综 述

攻读学位期间本人出版和公开发表的论著、论文发表论文

致 谢