灵芝HMG-CoA还原酶（HMGR）基因的克隆、功能验证及表达调控的初步研究

摘要

灵芝[(Ganoderma lucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst)]属于真菌界(Mycota),担子菌亚门(Basidiomycotina),层菌纲(Hymenomycetes),灵芝属(Ganoderma),是我国著名的药用真菌,已有2000多年的药用历史,具有重要的药理作用。灵芝三萜(灵芝酸)是灵芝的主要药效成分之一,具有抗癌、降血压、降血脂、抗过敏抗HIV-1和抗HIV-1的蛋白酶及转录酶等功能。 在灵芝HMGR基因的克隆方面,已经取得了一定的进展：扩增获得了灵芝HMGR基因的基因组全长；以原基时cDNA为模板,扩增获得了三个cDNA片断,进而推测出cDNA全长序列；另外还通过SEFA-PCR扩增获得了灵芝HMGR基因的启动子序列。 本试验根据已经获得的灵芝HMGR基因cDNA特异片断,设计两条引物,用TaKaRa公司的3'-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒扩增得到了3'非翻译区序列,再设计两对引物PCR扩增原基时cDNA获得cDNA全长序列,长3681bp,编码产生1226个氨基酸。 通过对HMGR基因的结构预测分析发现,HMGR基因含有三个结构域:N-端的疏水区(626 aa)、Linker(147 aa)和C-端的催化域(454 aa),并且在疏水区预测含有8个跨膜区。将预测的不含N-端疏水区但包含Linker和催化域的cDNA序列克隆到酵母表达载体pYF1845中,转入一个缺乏HMGR活性、生长需要甲羟戊酸的酵母突变株JRY1130。结果转化子可以在不含甲羟戊酸的培养基平板上生长,证实了所获得的HMGR基因cDNA序列的功能,而且表明N-端的疏水区对HMGR催化功能的实现不是必需的。 灵芝三萜是灵芝的次生代谢产物,其生物合成受到发育时期和诱导因子的调控。HMGR基因是三萜生物合成途径中的关键酶基因。RT-PCR检测灵芝HMGR基因在菌丝不同发育时期mRNA水平的表达量。结果表明,当灵芝菌丝生长到一定阶段(14天)后,随着培养时间的延长,HMGR基因表达量明显增加。 茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MJ)在细胞的多种逆境反应中起信号介导作用,对多种次生代谢产物的合成具有诱导作用。我们分别研究了不同浓度和不同诱导时间的MJ对灵芝菌丝中三萜含量和HMGR基因表达量。当MJ浓度为50 μM时,菌丝三萜含量最高,比阴性对照提高了25％,具有显著性差异(P<0.01)。除了10 μM的MJ外,用其他浓度诱导时,HMGR基因的表达量均有增加了,在100 μM的MJ作用下,HMGR的表达量最大,与阴性对照相比,提高了10倍。 茉莉酸甲酯的诱导时间与灵芝菌丝中三萜含量呈正相关,即MJ对菌丝的诱导时间越长,菌丝中三萜含量越高。而HMGR基因的表达量变化规律与茉莉酸甲酯的诱导时间的长短并不一致,呈正态分布,其中以茉莉酸甲酯作用5天的菌丝中表达量最大,与最小值6天相比,提高了284倍。 紫外诱变处理灵芝原生质体,经过初筛(菌丝生长速率)、精筛(菌丝干重和三萜含量)和稳定性试验(传代后菌丝三萜含量),获得了2株三萜含量稳定且显著(P＜0.01)提高的诱变株UV-3和UV-10。 测量2株三萜高产诱变株子实体中三萜含量筛选了诱变株UV-3,其在栽培袋中的菌丝生长速率及子实体中三萜含量分剔比出发菌株高了58.6％和29.4％。具有显著差异(P＜0.01)。SRAP-PCR结果说明,诱变株UV-3与出发菌株相比,DNA指纹图谱发生了明显改变。 RT-PCR检测HMGR基因在出发菌株和2株三萜稳定高产诱变株中mRNA水平的表达量。原始出发菌株的HMGR基因在mRNA水平的表达量比两株诱变株高,而诱变株UV-3和UV-10的HMGR基因在mRNA水平的表达量相等。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

一、灵芝药用成分研究

二、灵芝分子生物学研究

三、HMG-CoA还原酶的研究进展

四、定量RT-PCR检测基因的表达量

参考文献

第一章灵芝HMG-CoA还原酶(HMGR)基因cDNA的克隆及表达谱分析

第一节灵芝HMG-CoA还原酶(HMGR)基因cDNA的克隆、序列分析及功能验证

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第二节竞争性RT-PCR检测灵芝HMGR基因在菌丝不同发育阶段的表达特性

1实验材料

2实验方法

3结果与分析

第三节竞争性RT-PCR检测茉莉酸甲酯对HMGR基因mRNA表达水平的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

参考文献

第二章灵芝原生质体紫外诱变筛选三萜高产菌株及其HMGR基因表达量的比较分析

第一节灵芝原生质体紫外诱变筛选三萜高产菌株

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第二节竞争性RT-PCR法检测三萜高产诱变株HMGR基因mRNA表达水平

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

参考文献

全文总结

附 录

致 谢

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