大豆凝集素的分离纯化和细胞凝集活性的研究

摘要

本研究在亲和色谱法分离纯化大豆凝集素的基础上，通过比较大豆凝集素对兔和鸡小肠上皮细胞与红细胞的凝集作用，以及各种糖配体与大豆凝集素结合后，对其凝集活性的影响，寻求评价大豆凝集素抗营养活性的适宜方法。 试验一：采用亲和色谱法分离纯化大豆凝集素。以a-D-半乳糖为亲和吸附剂，以环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶为载体，将大豆粗粉抽提液吸附于经过0.15mol/L的NaCl溶液预先平衡的亲和色谱柱后，分别用0.15mol/L的NaCl洗脱液和含0.1mol/La-D-半乳糖的0.15mol/L的NaCI洗脱液分步洗脱，收集第二步洗脱液，将OD280大于0.1的各管合并、透析、冻干后即得到SBA提取产物。纯化的产物经pH 8.9的聚丙烯酰胺凝胶电泳(胶浓度为10％)，考马斯亮蓝染色，显示出一条与SBA标准品(sigwna)相同的着色带，说明用亲和色谱法可以获得纯度较高的大豆凝集素产物，得率为每100g大豆粗粉获得37±3.674mg最终提取物。 试验二：测定纯化的大豆凝集素对兔和鸡小肠上皮细胞和红细胞的凝集活性。测定大豆凝集素对红细胞的凝集能力时，采用2％兔红细胞悬液，测定了使兔红细胞50％凝集的蛋白质最低浓度。经血凝试验结果表明，使兔红细胞50％凝集的SBA蛋白质最低浓度为2.50-3.69μg/ml左右，而SBA对鸡的红细胞没有凝集作用。在测定对兔小肠上皮细胞的凝集能力时，采用荧光标记SBA与新鲜小肠上皮细胞结合后，观察荧光显微镜下荧光结合细胞比例的方法定量。结果表明大豆凝集素对兔和鸡的肠细胞具有相似的结合能力，其中SBA与兔肠细胞的结合率为30％左右。 试验三：测定糖配体对大豆凝集素凝集活性的影响。试验分别选取了a-D-半乳糖、D-氨基半乳糖、几丁质、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropcryl-β-D-sulfogalactosc，IPTG)和a-乳糖5种糖配体。先将5种糖配体分别与大豆凝集素结合，再分别比较SBA结合糖配体后对红细胞凝集活性和肠细胞结合率的影响。结果发现，除了几丁质外，几种糖配体都能降低大豆凝集素对兔血红细胞的凝集活性和肠细胞结合能力，各种糖配体对凝集活性与结合能力的影响排序大致相同。其中a-D-半乳糖的效果最显著。 总之，通过研究发现：①利用亲和色谱法可以获得纯度较高的大豆凝集素；②大豆凝集素能凝集兔红细胞，但不能凝集鸡红细胞；SBA与兔和鸡小肠上皮细胞的结合能力相似，说明用小肠上皮细胞结合率评价SBA的抗营养活性，可以避免SBA与血液红细胞凝集的种间差异。③加入特异性糖配体后，可以抑制SBA的血凝活性和小肠上皮细胞结合能力，通过筛选高亲和力的糖配体，有望寻找到外源添加糖配体消除SBA抗营养活性的方法。

目录

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引言

凝集素及其抗营养作用研究进展

1凝集素的研究概况

1.1凝集素的定义和分类

1.2凝集素的结构

1.3植物凝集素的性质

1.4植物凝集素的检测

1.5植物凝集素的灭活

2大豆凝集素的研究进展

2.1大豆凝集素的定义和理化性质

2.2大豆凝集素的主要生物学功能

2.3大豆凝集素的抗营养作用

2.4大豆凝集素的加工处理

2.5大豆凝集素的研究展望

3本研究的目的、意义和内容

3.1研究目的

3.2研究意义

3.2研究内容

第一章大豆凝集素的分离纯化与鉴定

1材料与方法

1.1透析袋的预处理

1.2 a-galactose-Sepharose亲和吸附剂的制备

1.3大豆凝集素的分离纯化

1.4 SBA的纯度鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.5大豆凝集素各阶段提取效果判断

2结果与分析

2.1大豆凝集素亲和层析的洗脱曲线

2.2纯度鉴定

2.3不同提纯阶段大豆凝集素的血凝能力比较

3讨论

4小结

第二章SBA对小肠上皮细胞和红细胞的凝集能力的研究

1材料与方法

1.1固定化红血球的制备（戊二醛法）

1.2 大豆凝集素（SBA）的红细胞凝集能力的测定

1.3 SBA对小肠上皮细胞的结合能力的测定

2结果与分析

2.1 SBA红细胞凝集能力的测定

2.2 SBA对新鲜红细胞凝集能力的测定

2.3 SBA对小肠上皮细胞的结合能力测定

3讨论

4小结

第三章糖配体对SBA凝集活性的影响

1材料与方法

1.1不同糖配体结合SBA后对红细胞凝集能力的测定

1.2不同糖配体结合SBA后对小肠上皮细胞结合能力的测定

2结果与分析

2.1不同糖配体结合SBA后对红细胞凝集能力的测定

2.2不同糖配体结合SBA后对小肠上皮细胞结合能力的测定

3讨论

4小结

论文总体结论和需进一步研究的问题

参考文献

致 谢

在读学位期间发表的论文