地衣芽孢杆菌B13耐高温α-淀粉酶基因的克隆和表达

摘要

耐高温α-淀粉酶是目前最重要的工业酶制剂之一,广泛应用于发酵、制糖等工业。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是国内生产高温α-淀粉酶的代表菌株之一。本文主要研究地衣芽孢杆菌B13高温α-淀粉酶(BLA)编码基因(amy)的克隆、序列分析及在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达。 用PCR方法从地衣芽孢杆菌B13的总DNA中扩增出一条约1.8kb的DNA片段,测序结果表明,该片段与B.licheniformis 584中的耐高温α-淀粉酶基因的同源性高达99％。将B.licheniformis B13耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中进行表达和表达产物活性测定,结果表明在大肠杆菌中,耐高温α-淀粉酶基因能利用自身的启动子及信号肽合成有活性的目标蛋白,并能分泌到胞外。 枯草芽孢杆菌是被广泛利用的来表达外源基因的良好宿主,但其本身包含有淀粉酶基因。利用无标记同源重组载体pDGIEF,敲除B.subtilis WB800的淀粉酶基因,构建了枯草芽孢杆菌WB800D,以此做为外源淀粉酶基因表达的良好宿主。利用穿梭载体pUBC19,将含有高温α-淀粉酶自身启动子序列和信号肽序列的amy基因与其进行体外重组,并转化B.subtilis WB800D,获得了表达菌株B.subtilis WB800D(pUBC19-amy)。但是,其表达量较低,活性不高。 利用穿梭载体pP43NMK,将含有信号肽序列的amy因片段与其进行体外重组,并转化B.subtilis WB800D,获得了表达菌株B.subtilis WB800D(pP43NMK-amy)。实验结果表明,在P43带动下,α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达,与地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子相比,采用P43启动子,α-淀粉酶表达水平提高了8.9倍。这项研究为构建高效表达耐高温α-淀粉酶基因工程菌奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1 α-淀粉酶的概述

1.1 α-淀粉酶的性质

1.2 α-淀粉酶的生产

2耐高温α-淀粉酶

2.1耐高温α-淀粉酶的结构

2.2热稳定性

2.3 pH值范围

2.4酶与金属离子

2.5耐高温α-淀粉酶的应用

2.6耐高温α-淀粉酶生产菌株的育种进展

3芽孢杆菌表达系统

3.1芽孢杆菌表达系统发展简史

3.2芽孢杆菌表达系统概述

3.3芽孢杆菌表达系统的载体

3.4芽孢杆菌表达系统中表达的基因

3.5枯草杆菌表达系统存在问题及今后发展方向

参考文献

第二章B.lichenifomis B13耐高温α-淀粉酶基因的克隆、序列分析和在大肠杆菌中的表达

1材料和方法

1.1菌株、质粒

1.2培养基

1.3酶、引物、抗生素和试剂

1.4地衣芽孢杆菌B13基因组DNA的提取

1.5大肠杆菌普通感受态细胞的制备及转化

1.6质粒DNA的小量提取

1.7质粒DNA的小量酶切

1.8目的基因和T载体的酶连体系

1.9 DNA的回收纯化

1.10 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析

1.11 Bacillus lichenifomis B13耐高温α-淀粉酶基因(amy)的扩增

1.12 amy基因的T-A克隆和测序

1.1 3测序结果分析

1.14 B.licheniformis B13耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的鉴定

2结果与分析

2.1 B.lichenifomis B13耐高温α-淀粉酶基因(amy)的克隆及序列分析

2.2 B.licheniformis B13耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中表达产物的鉴定

3讨论

本章小结

参考文献

第三章 B.lichenifomis B13耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

1材料和方法

1.1菌株、质粒

1.2培养基

1.3试剂和酶

1.4质粒DNA的大量提取

1.5质粒DNA的大量酶切

1.6 DNA片段酶连体系的建立

1.7 DNA片段的去磷酸化

1.8枯草芽孢杆菌感受态的制备及转化

1.9同源重组载体载体pDGIEF-ery的构建

1.10 B.subtilis WB800D的构建

1.11穿梭表达载体pUBC19-amy的构建

1.12表达菌株B.subtilis WB800D(pUBC19-amy)的构建

1.13表达菌株B.subtilis WB800D(pUBC19-amy)耐高温α-淀粉酶的活性检测以及表达产物的SDS-PAGE分析

2结果与分析

2.1B.subtilis WB800B中淀粉酶基因的敲除

2.2表达菌株B.subtilis WB800D(1)UBC19-amy)的构建

2.3表达菌株B.subtilis WB800D(pUBC19-amy)耐高温α-淀粉酶的活性检测以及表达产物的SDS-PAGE分析

3讨论

本章小结

参考文献

第四章P43启动子促进耐高温α-淀粉酶基因在芽孢杆菌WB800D中高效表达

1材料和方法

1.1菌株、质粒

1.2培养基

1.3试剂和酶

1.4分子操作

1.5耐高温α-淀粉酶活力测定方法

1.6含有信号肽序列的amy基因片段扩增

1.7穿梭表达载体pP43NMK-amy的构建

1.8表达菌株B.subtilis WB800D(pP43NMK-amy)的构建

1.9表达菌株B.subtilis WB800D(pP43NMK-amy)耐高温α-淀粉酶的活性检测及SDS-PAGE分析

1.10枯草芽孢杆菌表达菌株的发酵实验

2结果与分析

2.1表达菌株B.subtilis WB800D(pP43NMK-amy)的构建

2.2表达菌株B.subtilis WB800D(pP43NMK-amy)耐高温α-淀粉酶的活性检测及SDS-PAGE分析

2.3枯草芽孢杆菌表达菌株的发酵实验

3讨论

4本章小结

参考文献

附录

致谢