C57BL/6J小鼠精子冷冻与单精子胞浆内注射技术研究

摘要

随着生命科学研究的日益发展，实验动物科学也在我国得到快速的发展，小鼠是应用最为广泛的实验动物之一.C57BL/6J品系小鼠作为应用最广泛的一种近交系小鼠，因其遗传背景稳定，是研究基因突变的重要工具；多种转基因小鼠均以C57BL/6J品系小鼠为遗传背景。如何开展这些基因工程小鼠的保种工作，建立一套有效的小鼠种质资源保存方案显得尤为重要。胚胎生物技术和低温生物学技术的联合应用在小鼠保种中已获得成功，冷冻精子和胚胎业已成为建立冷冻库、保存特定品系最有效的策略。精子冷冻的技术操作方便、快速、无需特殊的设备，应用前景十分广阔。小鼠精子冷冻已成为小鼠种质资源保存的有效方法之一，其冷冻精子体外受精技术对于部分品系的小鼠来说已很成熟，但对于一些特殊品系如应用最广的C57BL/6J近交系小鼠及以C57BL/6J为遗传背景的转基因小鼠，冷冻精子体外受精卵裂率仍然很低.本实验以C57BL/6J小鼠为研究对象，旨在通过对该品系小鼠精子冷冻及冷冻精子的体外受精、单精子胞浆内注射技术的研究，全面提高该品系小鼠体外受精卵裂率，为C57BL/6J小鼠的资源保存奠定基础。 1 C57BL/6J、小鼠精子冷冻技术研究 本试验主要以C57BL/6J品系小鼠为研究对象，系统比较冷冻稀释液、解冻方法、获能时间和获能液、体外受精液、胚胎体外培养液等对该品系小鼠冷冻精子体外受精卵裂率与胚胎发育率的影响。结果表明：(1)以R18S3为基础液添加15％或20％卵黄离心上清液作为冷冻稀释液，可有效提高C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精卵裂率(分别为36％和40％)，但添加不同浓度的甘油或乙酰胺却会降低冻精体外受精卵裂率，混合添加卵黄和甘油冷冻效果不如单独添加卵黄，但比单独使用甘油效果要好；(2)采用37℃水浴15min和先60℃水浴6s再37℃水浴解冻15 min2种方法解冻精子，C57BL/6J小鼠冻精体外受精卵裂率无显著差异(P>0.05)，因一步解冻法操作简便，可作为常规解冻程序；(3)分别采用30、50和60min为C57BL/6J小鼠冻精的获能时间，体外受精卵裂率分别为17.3％、25％和19.4％，以50min获能效果最佳；(4)在100μl HTF体外受精液中分别添加1.0 IU/ml FSH和O.1μg/ml E2，冷冻精子体外受精卵裂率分别为24.1％和27.3％，与不添加对照组(25％)相比没有明显提高(P>0.05)；(5)在100μl/HTF中分别添加45μmol/L肾上腺素、75μmol/L亚牛磺酸、5 IU/ml肝素、7.5 mmol/L牛磺酸，以及不含BSA的TYH中添加0.75 mmol/MBCD作为精子获能液，结果只有添加5 IU/ml肝素可提高冷冻精子体外受精卵裂率，但无统计学差异(P>0.05)；用R18S3+15％卵黄上清液冷冻精子时，添加5 IU/ml肝素的体外受精卵裂率最高(49.3％)；若用R18S3+20％卵黄离心上清液冷冻，添加45μmaol/L肾上腺素组所获体外受精卵裂率和囊胚发育率最高；(6)体外培养实验表明，KSOM更适合桑椹胚前的发育，而CZB更适合桑椹胚向囊胚的发育；(7)采用R18S3+20％卵黄离心上清冷冻C57BL/6J小鼠精子，并配合使用100μL HTF+45μmol/L肾上腺素作为精子获能液，体外受精所获2-细胞胚胎20枚移植至1只受体小鼠，产仔4只，产仔率为20％。2 C57BL/6J小鼠ICSI技术的研究 以C57BL/6J品系小鼠7LDBA♂×C57BL/6♀辛(B6D2FI)杂交鼠为研究对象，以Piezo操作系统为技术支撑；通过小鼠卵母细胞胞浆内精子注射(ICSI)技术，系统比较不同注射针内径、不同显微操作液、不同采卵时间对ICSI结果影响，并比较鲜精、冻精体外受精和ICSI显微受精结果。结果表明：(1)使用内径为4～6μm的注射针，C57BL/6J小鼠ICSI胚胎卵裂率为88.5％，显著高于8～10μm内径组(85.7％对53.8％，P<0.05)：(2)C57BL/6J小鼠注射hCG后19h采卵进行ICSI操作，卵子存活率虽比注射后12或14h采卵组降低，但其卵裂率最高(92.7％)，囊胚发育率也最高(36％)；(3)C57BL/6J和B6D2F1小鼠卵使用Hepes-CZB显微操作液，ICSI操作后的卵子存活率分别为36.1％和61.2％，卵裂率为82.4％和63.1％，囊胚发育率为50％和45.8％；当操作液中添加3％蔗糖时，卵存活率分别为59.6％和80.2％，卵裂率为90.3％和1182.1％，两品系小鼠存活率和卵裂率较对照组都有显著提高(P<0.05)；囊胚发育率为35.7％和26.3％，有显著降低(P<0.05)；当操作液中添加0.5mg/L细胞松弛素B，ICSI操作后的卵子存活率为49.1％和73.0％，卵裂率为90.0％和82.0％，两品系小鼠存活率、卵裂率都得到显著提高(P<0.05)；囊胚发育率为37.0％和33.0％，显著下降(P<0.05)；(4)C57BL/6J小鼠鲜精常规体外受精的卵裂率为90.4％，与其冻精体外受精后的卵裂率(25.0％、36.0％、40.0％)相比差异显著(P<0.05)，与冻精单精注射后的卵裂率(53.8％)也差异显著(P<0.05)；但冻精ICSI卵裂率与冻精常规体外受精后的卵裂率相比，明显提高(P<0.05).冷冻精子ICSI后囊胚发育率显著低于新鲜精子常规体外受精后体外培养的囊胚率(56.3％对71.6％，P<0.05)；(5)用添加3％蔗糖的Hepes—CZB作为显微操作液，经R18S3冷冻稀释液冷冻保存的C57BL/6J小鼠精子解冻后进行ICSI注射，所获40枚2-细胞胚胎移植给ICR受体假孕小鼠，获得着床8 d胚胎13枚，妊娠率&32.5％。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：简写及缩略语

声明

前言

第一部分文献综述

第一章实验小鼠精子冷冻保存的研究进展

1精子冷冻保存研究简史

2 C57BL/6J小鼠精子冷冻保存现状

3精子冷冻保存原理

4精子的冷冻损伤

5小鼠精子冷冻保存方法

6冷冻精子的质量评定

7影响精子冷冻保存效果的因素

8 C57BL/6J品系小鼠及以其为遗传背景转基因小鼠精子冷冻

参考文献

第二章小鼠卵母细胞单精子胞浆内注射的研究进展

1小鼠ICSI的研究简史

2显微操作系统

3影响单精子胞浆内注射的因素

4小鼠ICSI的应用前景

参考文献

第二部分试验研究

第三章C57BL/6J小鼠精子冷冻保存技术研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第四章C57BL/6J小鼠ICSI技术的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

全文结论

图版

附录 溶液配制

致谢