NK细胞体外扩增体系建立及中药单体调节NK细胞抗肺癌功能及机制研究

摘要

研究背景：肺癌是世界上最常见的肿瘤之一。在我国发病率和死亡率高居榜首。目前治疗上以手术、化疗和放疗为主，辅以内分泌、中医药治疗，但仍存在较严重的并发症和毒副作用。因此，近年来以免疫细胞为主体的抗肿瘤免疫治疗方法备受关注，为2013年度最重要的十大科学突破之首。
　　NK细胞（Natural killer cells），即自然杀伤细胞。在人类，NK细胞被定义为CD3-CD56+的淋巴细胞，约占外周血淋巴细胞的10~15％，是连接机体固有免疫和获得性免疫的桥梁，在机体抗感染性疾病和恶性肿瘤免疫监视过程中均发挥重要作用。临床研究表明，人类NK细胞移植后能产生良好的移植物抗肿瘤效应，可以显著改善病人生活和生存质量，而且几乎不引起移植物宿主病。在恶性肿瘤的临床治疗试验中取得了较好的疗效。即便如此，NK细胞免疫治疗临床应用依然困难重重，难点首先在于：NK细胞只是一个很小的群体；其次，NK细胞移植后在体内存活时间短，活性难以维持。
　　研究表明多种中药成分可直接抑制肿瘤细胞生长与增殖、诱导肿瘤凋亡、影响周期信号通路中关键蛋白，在增强免疫细胞抗肿瘤功能及阻断肿瘤细胞免疫逃逸方面发挥重要作用，同时较化疗药物价格经济、毒副作用小，是潜在的免疫治疗新药，有望应用于临床。
　　研究目的：本论文针对NK细胞临床应用中的两个难点问题展开研究：1）以K562细胞为基础的基因工程细胞，通过在其表面基因修饰，建立更为优越的NK细胞体外扩增体系，并初步探讨其相关分子机制；2）寻找经济实用的中药活性单体成分，增强NK细胞对肿瘤杀伤活、阻断肿瘤细胞免疫逃逸，促进协同抗肺癌细胞作用及探讨可能的分子机制。
　　研究方法：1.体外实验：首先，通过PCR手段，构建CD137L/p SBSO sleeping beauty表达质粒。通过流式细胞仪筛选，利用构建的质粒转染K562细胞，构建mbIL-21-CD137L-K562稳定表达的人工抗原递呈细胞系，并检测NK细胞纯度及NK细胞表面受体配体表达情况。细胞计数NK细胞扩增效率，通过钙黄绿素释放试验检测体外扩增的NK细胞的杀伤活性。Western blot检测STAT-1-6磷酸化位点及其对NK细胞的影响。中药单体作用于靶细胞后，通过流式细胞仪检测特异性配体的表达，筛选出增强NK细胞激活性信号特异性配体的单体。通过CCK8检测中药活性单体对NK细胞活性的影响。通过钙黄绿素释放实验和杀伤实验等检测NK细胞杀伤活性。Elisa检测IFN-γ表达，流式细胞仪检测CD107α和NK细胞表面特异性受体表达；
　　2.体内实验：通过皮下注射A549细胞，建立皮下移植荷瘤小鼠模型。通过尾静脉注射NK细胞，腹腔注射中药活性单体，检测单体调节NK细胞抗肿瘤治疗效果。
　　结果：1．流式细胞方法检测m-IL-21、CD137等，筛选出mbIL-21-CD137L-K562细胞。与来自于外周血单核细胞共同培育后，检测CD3、CD16、CD56等NK细胞表面受体配体情况，确定成功建立基于人工抗原递呈细胞的NK细胞体外扩增体系，mbIL-21-CD137L-K562扩增的NK细胞纯度高；检测NK细胞的激活性受体和抑制性受体表达上调；细胞计数NK细胞扩增效率倍增。通过细胞毒性实验（钙黄绿素释放实验）等检测出具有较高的细胞毒性并使NK细胞持续扩增。通过Western blot检测发现IL-21可以激活STAT-3，其特异性抑制剂JSI-124可以失活STAT-3。STAT-3抑制剂削弱NK细胞增殖和细胞毒性，JSI-124可以损害NK细胞正常形态。
　　2．在体外实验中，多种中药单体处理肿瘤细胞，通过流式细胞仪检测表面MIC A/B、HLA-ABC的表达，推测青蒿素具有调节NK细胞杀伤功能。通过细胞活性实验MTT检测不同浓度青蒿素能抑制肿瘤细胞生长，CCK检测青蒿素能促进NK细胞生存活性；钙黄绿素释放实验、直接杀伤实验检测，低浓度青蒿素可以提高NK细胞对肺癌细胞的杀伤效应；流式细胞方法及Elisa检测表明青蒿素促进颗粒酶、IFN-γ分泌，并且主要发生在P53缺失的肺癌细胞。进一步探究其分子机制发现，青蒿素可以明显上调肺癌细胞表面的激活性受体NKG2D的配体MICA/B表达，而下调抑制性受体的特异性配体HLA-ABC的表达水平。体内实验也表明，NK细胞结合青蒿素治疗可抑制A549荷瘤小鼠肿瘤生长。
　　结论:1） STAT-3磷酸化是基于mbIL-21-CD137L-K562细胞的NK细胞扩增和发挥细胞毒作用所必需的表观修饰方式；2）青蒿素可以通过调节靶细胞表面MICA/B和HLA-ABC等分子表达水平，调节激活性信号，同时促进颗粒酶、穿孔素释放，提高NK细胞对A549、H1299、H1975细胞识别与杀伤能力；3）体外扩增体系，简单而且高效，联合传统中药，有望应用于临床。

目录

声明

缩 略 语

第一部分基于膜结合IL-21和CD137配体的基因工程细胞扩增NK细胞体系建立

1 引言

2 方法和材料

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分中药活性单体增强NK细胞抗肺癌免疫治疗及其分子机制研究

1 引言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

5结论

参考文献

攻读博士学位期间的科研业绩

综述:NK细胞在抗肿瘤治疗中的研究进展

1. NK细胞概述

2 NK细胞活化

3 NK细胞的抗肿瘤机制

4 NK细胞在肿瘤治疗中的应用

5 结论及展望

参考文献

致谢