RUNX3在瘢痕疙瘩发病机制中的作用及其表达与Pa-PDT治疗疗效的关系

摘要

瘢痕疙瘩是一种特殊的瘢痕类型，是一种皮肤上的结缔组织肿瘤，在形态学方面，其肿块隆起于皮肤的表面，表面光滑，质地坚硬，界限欠规则，在组织学方面，成纤维细胞过度增生，细胞外基质成分增加，胶原蛋白过度沉积，具有过度生长、病变的发展超出原损伤界限、呈瘤样增生，且邻近组织也受到相应的侵犯、始终不发生退化和单纯手术治疗后常出现复发现象，在临床上，伴有不同程度的瘙痒和疼痛，常造成功能障碍和外形破坏而影响美观和病人的心理，严重的损害了病人的生活质量。
　　光动力疗法是医治恶性肿瘤的方法之一，它在不损害健康组织的情况下，在肿瘤组织中利用一种光敏剂的光动力杀伤癌细胞的作用和选择性聚集作用，造成肿瘤组织的特定部位受到损害。光敏剂的性质可直接影响光动力疗法的治疗效果，因此光敏剂的发展对光动力疗法的发展具有重要的意义。脱镁叶绿酸（Pa）一个新的成熟的光敏剂，有抗癌活跃性和最低毒性已被很多研究者所报道。脱镁叶绿酸-光动力疗法（Pa-PDT）它在各种类型的癌症中增加细胞凋亡和减少癌细胞的增殖能力。Pa-PDT治疗瘢痕疙瘩的疗效及其作用机制的研究尚无报告。因此采用Pa-PDT，探索治疗瘢痕疙瘩的新的方法。最近研究的肿瘤治疗重点在是患者的个性化治疗。分析每个瘢痕疙瘩病人，根据病人的需要制定和实施有效的治疗方案。最近,一些研究人员已经表明,runt-related转录因子3(RUNX3)是一种预测Pa-PDT敏感性的分子目标。
　　目的:阐明RUNX3在瘢痕疙瘩发病机制中的作用,探讨Pa-PDT对瘢痕疙瘩的治疗效果,并进一步研究RUNX3表达对瘢痕疙瘩Pa-PDT敏感性的影响。同时用瘢痕疙瘩成纤维细胞建立瘢痕疙瘩裸鼠模型。
　　方法：
　　1）利用瘢痕疙瘩病理组织原代培养瘢痕疙瘩成纤维细胞；
　　2）利用免疫细胞化学法检测原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中Vimentin,α-SMA及type I collagen的表达；
　　3）利用3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl Tetr-azolium bromide(MTT) assay探讨Pa对瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞毒性并分析细胞Pa-PDT的可行性；
　　4）实时定量PCR分析瘢痕疙瘩发病机制和凋亡相关基因：比较性地研究用Pa-PDT处理过和未处理过的成纤维细胞中增殖细胞核抗原、I型胶原蛋白表达；
　　5）ROS生成：荧光探针,2′7′dichlorofluorescin diacetate dye是用于检测每一组表达的成纤维细胞中细胞内 ROS水平；
　　6） Pa-PDT后评估凋亡细胞死亡：比较性的研究仅用Pa处理过的成纤维细胞和接受Pa-PDT处理过的成纤维细胞两组中凋亡细胞死亡；
　　7）Pa-PDT导致凋亡相关蛋白表达：通过免疫印迹分析，比较性的研究 Pa处理过的成纤维细胞组和Pa-PDT处理过的成纤维细胞组中的半胱天冬酶-3,活化型半胱天冬酶-3和降解产物表达；
　　8）外科手术切除的瘢痕疙瘩样本的免疫组织化学，检测瘢痕疙瘩组织中RUNX3的表达及其意义；
　　9）利用免疫细胞化学法检测原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中RUNX3的表达；
　　10）利用针对RUNX3小干扰RNA压低 RUNX3的表达，观察瘢痕疙瘩纤维细胞PCNA表达的改变；
　　11）利用实时定量PCR检测Pa-PDT对瘢痕疙瘩成纤维细胞 RUNX3表达的影响；
　　12）比较观察Pa-PDT对RUNX3阳性细胞株及阴性细胞株的疗效，针对Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纤维细胞中PCNA，I型胶原蛋白的表达，ROS生成及凋亡发生作比较；
　　13）在瘢痕疙瘩成纤维细胞中利用针对RUNX3小干扰RNA压低 RUNX3的表达，观察Pa-PDT疗效的改变；
　　14）建立瘢痕疙瘩成纤维细胞裸鼠动物模型：体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞与细胞基底膜基质胶（Matrigel）混合后以细胞浓度为1.0×107/ml、3.0×107/ml、5.0×107/ml接种于裸鼠皮下，接种量为0.1ml，观察瘤体形成和生长情况，筛选适宜接种浓度；用已形成的瘢痕疙瘩瘤体进行体内传代，建立移植模型。
　　结果：
　　1）成功培养瘢痕疙瘩成纤维细胞并命名为KF1，KF2，KF3，KF4及KF5；
　　2)原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中检测到波形蛋白,α-SMA,和I型胶原蛋白的表达；
　　3）Pa对四组瘢痕疙瘩成纤维细胞呈现较低的细胞毒性及充分的积累；
　　4）Pa-PDT严重影响瘢痕疙瘩成纤维细胞活力；
　　5）经过Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纤维细胞中增殖细胞核抗原、I型胶原蛋白表达减少；
　　6）经过Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纤维细胞中ROS生成显著增高；
　　7）经过Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纤维细胞中调亡细胞数量显著增多；
　　8）经过Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纤维细胞中cleaved caspase-3及cleaved-PARP的表达显著增高；
　　9）RUNX3的核表达在16个(50％)瘢痕疙瘩组织样本中被发现，但在6个正常皮肤样本中却没有发现。在瘢痕疙瘩组织中 RUNX3的核表达与瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖指数及伴有临床症状正相关；
　　10) RUNX3的蛋白表达可在KF1，KF2中检测到，但在 KF3，KF4及KF5中未检测到RUNX3蛋白表达；
　　11）在瘢痕疙瘩成纤维细胞中利用针对RUNX3小干扰RNA压低 RUNX3的表达，可观察到PCNA表达降低；
　　12）Pa-PDT可引起瘢痕疙瘩成纤维细胞中 RUNX3表达降低；
　　13）Pa-PDT后与RUNX3阴性细胞株相比PCNA及type I collagen的降低，ROS生成及凋亡细胞的增多都在RUNX3阳性细胞株更明显；
　　14）在瘢痕疙瘩成纤维细胞中利用针对RUNX3小干扰RNA压低 RUNX3的表达可降低Pa-PDT的细胞毒性；
　　15）成功建立瘢痕疙瘩成纤维细胞裸鼠动物模型，并筛选出较适宜的细胞接种浓度为5.0×107/ml，体内传代后瘤体依然存活增大，二者组织病理未见明显差异。
　　结论：
　　1）经过Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纤维细胞中ROS生成显著增加，凋亡细胞的数量显著增多，抑制成纤维细胞增殖；
　　2）在瘢痕疙瘩组织中RUNX3的核表达与瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖指数及伴有临床症状正相关；
　　3）Pa-PDT严重影响瘢痕疙瘩成纤维细胞生存率。此细胞毒性明显依赖于 RUNX3的表达；
　　4）ROS生成和凋亡细胞的数量的增多与RUNX3表达正相关；
　　5）裸鼠皮下接种人瘢痕疙瘩成纤维细胞可建立瘢痕疙瘩裸鼠动物模型。
　　Pa-PDT很有可能是治疗瘢痕疙瘩患者（KD）的一个潜在的治疗方式，而且作为瘢痕形成促使者的RUNX3可能增加成纤维细胞对Pa-PDT的敏感性。作为评估瘢痕患者对Pa-PDT敏感性预测生物标志物，RUNX3应该进一步研究。

目录

声明

中英文符号说明

前言

第一章 瘢痕疙瘩成纤维细胞株的建立

1.1材料和试剂

1.2实验方法

1.3结 果

第二章 Pa-PDT治疗瘢痕疙瘩的疗效及机制的影响

2.1材料和试剂

2.2实验方法

2.3结 果

第三章 RUNX3表达对Pa-PDT治疗瘢痕疙瘩的疗效及机制的影响

3.1材料和试剂

3.2实验方法

3.3结 果

第四章 RUNX3表达在瘢痕疙瘩发病过程中的作用

4.1材料和试剂

4.2实验方法

4.3结 果

第五章 瘢痕疙瘩裸鼠动物模型的建立与评估

5.1材料与仪器

5.2实验方法

5.3 结果

讨论

结论

参考文献

致谢

综述:瘢痕疙瘩的发病机制与治疗的研究进展

附录A：攻读学位期间发表的论文

附录B：攻读学位期间的科研成果

附录C：攻读学位期间参加的学术活动