大鼠脂肪间充质干细胞复合胶原/透明质酸支架成软骨分化的实验研究

摘要

关节软骨损伤后有限的自身修复能力及其对人体功能的严重影响，使其成为骨科基础和临床研究中的热点和难点课题，目前尚未得到很好的解决。传统的治疗如微骨折、磨削成形术、骨膜软骨膜移植、骨软骨移植、人工关节置换等均存在一定的不足。近年来组织工程的发展有望成为治疗软骨损伤的新方法。组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理，对病损组织结构和功能的修复与重建进行研究开发的一门新兴学科。与胚胎干细胞、基因工程一起被认为是生命科学发展史上的又一个里程碑，标志着人类将走出单纯器官移植领域，步入组织、器官再造的新领域。但目前组织工程软骨应用急需解决的问题有：①具有较强增殖能力和多分化潜能的细胞；②合适的细胞载体；基于以上要求，本实验进行了以下三部分实验的研究。 第一章大鼠脂肪间充质干细胞分离、培养及生物学特性的实验研究 目的:掌握大鼠脂肪间充质干细胞的分离、培养和扩增的方法，并探讨其部分生物学特性。 方法:无菌技术下切取大鼠双侧腹股沟脂肪垫，加入适量I型胶原酶消化获取细胞，接种入含10％新生牛血清的DMEM培养液，倒置显微镜下连续观察细胞形态变化。取传代细胞用流式细胞仪和免疫细胞化学检测表面抗原标志CD29、CD34、CD44。MTT法测定第2、5、10代细胞的生长曲线。并测定细胞的贴壁率。 结论:从大鼠脂肪中分离的细胞具有间充质干细胞的特性，能长期培养，生长稳定、增殖较快，可以作为组织工程的种子细胞。 第二章大鼠脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化的实验研究 目的:探讨ADMSCs向成软骨方向分化的条件，为进一步实验打下基础。 方法:按照第一章实验方法分离培养细胞。取第5代细胞，分别以1×10<'7>／mL和5×10<'6>／mL的细胞密度行“micromaSS”法接种，加入诱导培养基定向诱导培养，即1％新生牛血清+1ng／mL的TGF-βl+6.25μg／mL转铁蛋白+6.25μg／mL胰岛素。部分培养孔中加入0.1nmol／mL地塞米松，于诱导培养2w时进行阿尔新兰和甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色。于诱导培养7d、14d用RT-PCR鉴定II型胶原mRNA表达。 结论:大鼠ADMSCs在新生牛血清、TGF-βl、转铁蛋白、胰岛素的作用下可以向成软骨细胞分化，而且以1×10<'7>／mL的细胞密度诱导培养成软骨能力要高于5×10<'6>／mL。地塞米松可以加速其成软骨分化。 第三章大鼠脂肪间充质干细胞复合胶原／透明质酸支架成软骨分化的实验研究 目的:探讨大鼠脂肪ADMSCs在胶原／透明质酸三维支架上培养、定向诱导分化成软骨的能力。 方法:按照第一章实验方法分离培养细胞。取第5代细胞，以1×10<'7>／mL的细胞密度接种于胶原海绵／透明质酸支架上，加入诱导培养基定向诱导培养，即1％新生牛血清+1ng／mL的TGF-β1+6.25μg／mL转铁蛋白+6.25μg／mL胰岛素+O.1nmol／mL地塞米松。于培养3周时将支架制备成石蜡切片分别进行HE染色、阿尔新兰染色、加苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。同时进行RT-PCR鉴定Ⅱ型胶原mRNA的表达。并对支架进行电镜扫描。 结论:大鼠ADMSCs接种在胶原海绵／透明质酸支架，经成软骨诱导分化后，形成了具有部分软骨组织特性的物质。

目录

文摘

英文文摘

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英文缩略词

前言

第一章大鼠脂肪间充质干细胞分离、培养及生物学特性的实验研究

第二章大鼠脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化的实验研究

第三章大鼠脂肪间充质干细胞复合胶原/透明质酸支架成软骨分化的实验研究

参考文献

综述一关节软骨损伤治疗的研究进展

综述二组织工程修复关节软骨损伤的研究进展

致谢

攻读学位期间主要的研究成果