青藤碱对人CD4T细胞增殖及细胞内NFAT和IFNγ蛋白表达影响的体外研究

摘要

目的：通过研究青藤碱（SIN）对人外周血CD4+ T淋巴细胞增殖及细胞内活化T细胞的核因子（NF-AT) 和干扰素-γ（IFN-γ) 蛋白表达的体外影响，进一步探讨SIN对人外周血CD4+ T淋巴细胞的免疫抑制作用，为SIN在器官移植免疫治疗的临床应用提供理论依据。 方法：在衡阳市中心血站采集一健康人肘静脉血50ml，肝素（10U/ml）抗凝。用淋巴细胞分离液从血液标本中分离人外周血单个核细胞（PBMC），并制成PBMC悬液。通过免疫磁珠分离法从PBMC悬液中分选CD4+ T淋巴细胞。将得到的CD4+ T淋巴细胞用10％ 小牛血清（FCS）RPMI-1640完全培养液在37℃、5％CO2条件下培养。CD4+ T淋巴细胞经植物血凝素（终浓度为5μg/ml）和白介素-2（Interleukin-2，IL-2，终浓度为100U/ml）扩增，将扩增后的细胞用PBS洗3遍，继续培养（细胞培养液中不含rIL-2和PHA）1天后，按照以下方式均分为5组细胞（每组3份）：1）对照组：细胞培养液中不加入任何药物；2）CsA组：细胞培养液中加入终浓度为50ng/ml的CsA溶液；3) 低浓度SIN组：细胞培养液中加入终浓度为10μmol/L 的SIN溶液；4)中浓度SIN组：细胞培养液中加入终浓度为200μmol/L 的SIN溶液； 5)高浓度SIN组：细胞培养液中加入终浓度为1000μmol/L 的SIN溶液。6小时后，各组细胞培养液中加入终浓度为1μg/ml的抗CD3单克隆抗体。再培养24小时后，对各组细胞进行以下检测：1）Western blotting法检测NF-AT的蛋白表达；2）MTT比色法检测细胞增殖；3）FCM检测IFN-γ表达水平。 结果： 1、Western blotting法检测NF-AT蛋白的相对表达量：1）对照组：1.3459+0.0063；2）CsA组：0.2959+0.0118；3）低浓度SIN组：1.3047+0.0036；4）中浓度SIN组：0.8965+0.0272；5）高浓度SIN组：0.4900+0.0112。低浓度SIN组与对照组比较，差异无显著性；其余各组两两比较，差异均有显著性；CsA组NF-AT的蛋白表达最低；SIN浓度与人外周血CD4+ T淋巴细胞NF-AT蛋白表达之间存在显著负相关关系。 2、MTT比色法测定OD值，计算细胞增殖抑制率（％）：1）对照组：0.00±0.00；2）CsA组: 75.98±2.05；3）低浓度SIN组：2.41±0.14；4）中浓度SIN组：31.49±2.04；5）高浓度SIN组：44.25±0.91。低浓度SIN组与对照组比较，差异无显著性；其余各组两两比较，差异均有显著性；细胞增殖抑制率由高到低依次为：CsA组、高浓度SIN组、中浓度SIN组、低浓度SIN组、对照组；SIN浓度与人外周血CD4+ T细胞增殖抑制率之间存在正相关关系。 3、经不同浓度的SIN处理后，人外周血CD4+ T淋巴细胞增殖抑制率与细胞NF-AT蛋白表达之间存在显著负相关关系。 4、FCM检测IFN-γ表达（％）：1）对照组：21.07±0.36；2）CsA组：8.91±0.38；3）低浓度SIN组：20.48±0.87；4）中浓度SIN组：15.19±0.25；5）高浓度SIN组：9.81±0.11。低浓度SIN组与对照组比较，差异无显著性；其余各组两两比较，差异均有显著性；SIN浓度与人外周血CD4+ T淋巴细胞IFN-γ的表达率之间存在负相关关系； 5、经过不同浓度SIN处理后，人外周血CD4+ T细胞NF-AT蛋白表达相对值与IFN-γ表达水平之间存在显著正相关关系。 结论： 1、SIN呈浓度依赖性降低人外周血CD4+ T淋巴细胞NF-AT的蛋白表达； 2、SIN呈浓度依赖性抑制人外周血CD4+ T淋巴细胞的增殖； 3、SIN对人外周血CD4+ T淋巴细胞增殖的抑制与其降低NF-AT蛋白表达相关； 4、SIN呈浓度依赖性下调人外周血CD4+ T淋巴细胞IFN-γ的表达水平； 5、SIN下调人外周血CD4+T淋巴细胞IFN-γ的表达与其降低NF-AT蛋白表达相关。