siRNA抑制STGC3基因表达对NIH3T3细胞生长增殖的影响

摘要

目的：STGC3基因是新近克隆的一个候选抑瘤基因。本研究以STGC3基因阳性表达的鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞为模型，采用siRNA技术，使NIH3T3细胞的STGC3基因表达下调，观察STGC3基因表达下调对NIH3T3细胞增殖的影响。 方法：构建针对STGC3基因 mRNA的pSilencer3.1-STGC3-siRNA表达载体，经脂质体转染，导入NIH3T3细胞，G418筛选，建立稳定的pSilencer 3.1- STGC3-siRNA/NIH3T3细胞系。RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学方法，检测STGC3基因mRNA和蛋白表达。通过HE染色、绘制生长曲线、软琼脂集落形成实验及流式细胞仪分析，观察STGC3基因表达下调后，NIH3T3细胞形态、增殖速度、克隆形成率和细胞周期分布变化。 结果：重组质粒DNA经酶切和测序鉴定，结果均证实pSilencer3.1-STGC3-siRNA表达载体构建成功。将pSilencer3.1-STGC3-siRNA和pSilencer3.1质粒分别转染NIH3T3细胞，G418筛选阳性细胞克隆，经RT-PCR、Western blotting及免疫细胞化学方法检测结果表明，成功建立了STGC3基因表达下调的NIH3T3细胞系。普通光学显微镜下观察，pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3细胞与两对照组相比，核染色加深，细胞变得细长；细胞生长曲线结果显示：pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3细胞较pSilencer3.1/NIH3T3细胞和NIH3T3细胞生长速度快；软琼脂集落形成实验结果证实， pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3组、pSilencer3.1/NIH3T3组和NIH3T3组克隆形成率分别为(6.4±1.0)％、(2.2±0.3)％和(2.1±0.3)％, pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3组克隆形成能力较两对照组显著增强；流式细胞仪检测结果：pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3组较对照组细胞群体中处于S期和G2的细胞数目增加，G0/G1期细胞数目减少。 结论： 1．构建了pSilencer3.1-STGC3-siRNA真核表达载体。 2．建立了STGC3基因表达下调的pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3细胞系。 3．siRNA抑制STGC3基因表达可促进NIH3T3细胞增殖。