小鼠TNF-α诱导蛋白TNFAIP1与p50及PCNA相互作用

摘要

为了研究TNFAIP1的功能,我们从小鼠肝脏组织分离了小鼠TNFAIP1、p50和PCNA三个基因,以正确的读码框连入一系列真核和原核表达载体中.将这些重组质粒转化E.coli.DH5α,挑阳性菌落酶切鉴定后送去测序.首先将两组重组质粒TNFAIP1和p50,TNFAIP1和PCNA分别对HeLa细胞瞬时转染后进行免疫共沉淀实验,Western blot结果显示出每组基因编码的蛋白质能够发生相互作用.然后在原核细胞E.coli.的DE3感受态细胞中表达出含不同接头的重组蛋白(TNFAIP1的GST融合蛋白、p50和PCNA的His-tag融合蛋白),提纯这三种融合蛋白,通过pull-down实验进一步证实了小鼠TNFAIP1和p50及PCNA的直接作用.小鼠TNFAIP1基因用NCBI网站的软件分析到位于染色体110q25 cM的位置,其间距为12.9kb,包含七个外显子.该蛋白的N端具有一个BTB/POZ结合域和C端具有一个PCNA的保守结合域(QTKV-EFP).有研究表明,这个BTB/POZ结合域和PCNA的结合域都在进化中具有保守性.作者的一系列实验证明了小鼠TNFAIP1蛋白与DNA聚合酶δ的亚单位p50,同时与PCNA都能发生直接的相互作用.由此推测小鼠TNFAIP1蛋白可能参与DNA复制过程,这能为深入研究人类TNFAIP1基因的功能提供参考.

目录

文摘

英文文摘

英文缩写表

主要仪器设备

前言

1.材料与方法

1.1材料与试剂

1.2方法

1.2.1小鼠刖脏组织RNA的抽提

1.2.2RT-PCR扩增TNFAIP1、PCNA和p50编码基因

1.2.3TNFAIP1、PCNA和p50编码基因重组载体的构建

1.2.4在株核细胞中的蛋白质表达及提纯

1.2.5细胞培养、转染和荧光定位

1.2.6抗体的制备及检测

1.2.7蛋白pull-down质和免疫共沉淀

2.结果与分析

2.1计算机序列分析

2.2TNFAIPI和p50编码基因在原核细胞中蛋白质表达及提纯

2.3TNFAIPI在真核细胞内的荧光定位

2.4抗体的制备

2.5蛋白质pull-down

2.6免疫共沉淀

3.讨论

参考文献

发表论文

致谢

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