SARS-CoV S1基因的巴斯德毕赤酵母表达及阻断多肽的研究

摘要

严重急性呼吸道综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）又称“非典型性肺炎”，或“非典”，主要表现为肺炎及渐进性呼吸衰竭，死亡率为10％左右。它于2002年11月在中国广东省首先爆发，然后迅疾传播至全球32个国家及地区，其病原为一种新的冠状病毒（SARS associated coronavirus，SARS-CoV）。目前尚无特效药物用于SARS治疗，正在研究的各种抗病毒方法包括：用模拟受体分子或病毒的受体结合蛋白封闭病毒受体相互作用、用小肽分子抑制病毒与细胞膜间的融合、用特定中和表位研制亚单位疫苗等。SARS-CoV刺突蛋白S1是与病毒主要受体血管紧张素转化酶2（angiotensin convening enzyme 2，ACE2）相结合的病毒蛋白，其受体结合功能区包括在第318-510个氨基酸残基间的193个氨基酸片段内，该片段同时包含多个中和表位。本研究通过克隆表达SARS-CoV的S1蛋白受体结合区，用表达的S1蛋白为靶蛋白，从噬菌体展示随机肽库中筛选特异性结合多肽，筛选阻断多肽。为进一步研究病毒致病机理及抗病毒药物奠定了基础。 本研究通过对S1基因修饰，在编码氨基酸不发生改变的前提下设计多对引物采用Over-Lap PCR对含有受体结合区的S1基因（777-1683，1041-1050，1236-1248，1317-1335，1590-1605）位存在的多个AT重复序列进行核苷酸置换。修饰后的S1基因克隆于酵母表达载体pPIC9K中，诱导上清经过SDS-PAGE和Western Blot检测，证实S1蛋白在巴斯德毕赤酵母中获得了表达。紫外分光光度计测定S1蛋白在酵母表达产量为69mg/L，说明巴斯德毕赤酵母是一种适合S1蛋白表达的系统。表达的S1蛋白作为诊断抗原检测人的阳性血清，ELISA结果证明了表达产物具有很好的免疫原性。 经过饱和硫酸胺纯化的S259-561蛋白作为靶蛋白，从十二肽库中筛选与其特异性结合的多肽。经过3轮筛选，并经过ELISA分析，得到8个阳性噬菌体克隆。

目录

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书

摘要

1.文献综述

2.实验材料与方法

3结果与分析

4讨论

5结论

参考文献

致谢

附录 硕士期间发表论文