超嗜热古菌真核同源的Orc1/Cdc6蛋白与复制原点之间的相互作用研究

摘要

极端嗜热古菌硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus P2)含有三个有活性的复制原点和三个真核类似的Orc1/Cdc6蛋白(命名为SsoCdc6-1， SsoCdc6-2和SsoCdc6-3)，因此成为研究真核生物复杂DNA复制机制的理想材料。但是目前还不清楚古菌的这种多个Orc1/Cdc6蛋白之间能否通过功能性的相互作用共同来调控DNA复制起始。本研究采用纯化的复制起始蛋白SsoCdc6及其突变体，在体外比较研究了它们与两个复制原点DNA之间的相互作用，特别是首次对古菌的多个SsoCdc6蛋白相互调控它们与原点DNA的相互作用进行了系统的生化分析。本研究主要取得了以下几个方面的结果：
　　 1.构建了SsoCdc6-2蛋白和SsoCdc6-2的C-末端缺失体(SsoCdc6-2△C)的大肠杆菌表达菌株，并通过热处理和Ni-NTA镍琼脂糖凝胶亲和纯化等步骤获得纯度达99％以上的SsoCdc6蛋白和SsoCdc6△C蛋白；针对S.solfataricus复制原点oriC1和oriC2的结构特征，设计了分别包括分叉和平端两种结构的三组特异性DNA底物。这些底物的共同特征是含有相互重叠的SsoCdc6结合位点。
　　 2.通过一系列电泳迁移率改变实验(EMSA)，发现SsoCdc6-1能够刺激SsoCdc6-2和SsoCdc6-3的DNA结合活性；相反，SsoCdc6-3抑制SsoCdc6-1与DNA底物的结合。而且它们的C-末端缺失体(SsoCdc6△C)基本保留了这种类似的调控功能。因此，三个SsoCdc6蛋白能够相互调控(正调控或者负调控)各自对原点特异性DNA的结合。
　　 3.采用Pull-down/Western blot分析，发现了如下几组蛋白间物理性的相互作用：SsoCdc6-1/SsoCdc6-3，SsoCdc6-1△C/SsoCdc6-3，SsoCdc6-1/SsoCdc6-2，SsoCdc6-1△C/SsoCdc6-2，SsoCdc6-2/SsoCdc6-3，SsoCdc6-2/SsoCdc6-3△C。另外，采用细菌双杂交技术，检测到了三个SsoCdc6蛋白与另一个复制起始蛋白SsoMCM均能发生物理的相互作用。
　　 4.构建了SsoCdc6-2蛋白WalkerA模体的定点突变体(SsoCdc6-2KA)的大肠杆菌表达菌株，通过优化表达条件获得了重组蛋白。进一步的EMSA实验表明，SsoCdc6-2KA保留了结合DNA的特性但失去了自磷酸化的功能。
　　 DNA复制过程是个十分复杂的过程，它需要蛋白质-蛋白质之间和蛋白质-DNA之间高度协调性的相互作用。极端嗜热古菌S.solfataricus的DNA复制机制是目前研究的热点和前沿，本研究首次系统阐明的古菌多个复制起始蛋白Orc1/Cdc6之间功能性的相互作用机制等研究成果，不仅对于我们深入理解这种古老微生物本身的DNA复制及遗传规律奠定了基础，同时也为最终阐明真核生物复杂的DNA复制调控机制提供了重要线索。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1前言

1.1古菌

1.1.1三域学说

1.1.2古菌域的界和古菌多样性

1.1.3古菌的细胞结构

1.1.4古菌的基因组

1.1.5古菌的转录

1.1.6古菌的翻译

1.2极端嗜热古菌和硫化叶菌

1.2.1嗜热特性

1.2.2硫化叶菌

1.3古菌DNA复制概述

1.3.1复制原点

1.3.2起始阶段

1.3.3延伸阶段

1.3.4古菌染色质

1.4研究目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2 PCR引物

2.1.3电泳迁移率改变实验(EMSA)用的DNA寡核苷酸链

2.1.4培养基、抗生素及培养温度

2.1.5试剂

2.1.6抽提液和缓冲液

2.1.7实验仪器

2.2实验方法

2.2.1核酸操作方法

2.2.2大肠杆菌感受态制备及常规转化

2.2.3蛋白质SDS-PAGE

2.2.4 Ssocdc6、Ssocdc6ΔC和Ssomcm基因的克隆、表达和纯化

2.2.5 DNA底物的同位素标记

2.2.6电泳迁移率改变实验(EMSA)

2.2.7 Pull-down实验

2.2.8抗体的制备和Western blot实验

2.2.9细菌双杂交实验

2.2.10体外自磷酸化实验

3 结果与分析

3.1 SsoCdc6-2、SsoCdc6-2ΔC和SsoMCM的基因克隆、原核表达和纯化

3.1.1 SsoCdc6-2、SsoCdc6-2ΔC和SsoMCM原核表达载体的构建

3.1.2 SsoCdc6-2、SsoCdc6-2ΔC和SsoMCM的表达和纯化

3.1.3小结

3.2 EMSA实验中DNA底物的设计

3.3 EMSA实验结果

3.3.1 SsoCdc6-1和SsoCdc6-2与DNA底物D1的结合

3.3.2 SsoCdc6-2和SsoCdc6-3与DNA底物D2的结合

3.3.3 SsoCdc6-1和SsoCdc6-3与DNA底物D3的结合

3.3.4 SsoCdc6三个起始蛋白相互调控各自对DNA底物D3的结合

3.3.5小结

3.4三个SsoCdc6复制起始蛋白两两之间的物理相互作用

3.4.1无标签（untagged）SsoCdc6蛋白的表达和纯化

3.4.2三个SsoCdc6蛋白两两之间的物理相互作用

3.4.3小结

3.5起始蛋白SsoCdc6与解旋酶SsoMCM之间的相互作用

3.5.1双杂交重组质粒pBTCdc6-2、pBTMCM和pTRGMCM的构建

3.5.2 SsoCdc6与SsoMCM之间的相互作用

3.5.3小结

3.6 SsoCdc6-2突变体SsoCdc6-2KA基本生化性质的研究

3.6.1 SsoCdc6-2KA原核表达载体pET15bCdc6-2KA的构建

3.6.2 SsoCdc6-2KA的表达和纯化

3.6.3 SsoCdc6-2KA蛋白基本生化性质的研究

3.6.4小结

4 总结与讨论

参考文献

致谢

附录 已发表的文章