生长抑素DNA疫苗免疫小鼠的基因表达与免疫应答规律研究

摘要

生长抑素是由下丘脑分泌的一种神经多肽，能抑制GH释放进而抑制动物生长。目前本实验室已完成生长抑素DNA疫苗的构建工作并用于临床试验，本实验采用器官成像、冰冻切片、免疫组化等检测手段研究以减毒沙门氏菌为载体的无抗性生长抑素基因疫苗C500（pGS/2SS-M4GFP-asd）免疫后小鼠的基因表达与免疫应答规律，旨在探索生长抑素基因疫苗对小鼠的免疫应答持续时间、免疫应答产生部位等，为后续的临床动物实验以及将来的生产应用提供实验依据。
　　 整个实验分为以下3个部分：
　　 1.抗生长抑素抗体检测。
　　 取54只3周龄Balb/C小鼠及90只7周龄昆明小鼠，各分为S、C和P组，实验S组免疫非抗性pGS/2SS-M4GFP-asd疫苗，阴性对照C组免疫C500空菌，空白对照P组免疫PBS溶液。分别检测免疫后不同时间段的血浆生长抑素抗体水平，结果显示：Balb/C小鼠免疫后13d；昆明小鼠免疫后9d，实验组抗体水平显著上升。提示小鼠免疫生长抑素基因疫苗后，能够产生针对于生长抑素的特异性抗体，表明有望通过免疫中和途径降低血浆中生长抑素浓度，从而可以起到促生长的作用。
　　 2.器官表达。
　　 通过荧光显微镜观察融合目的基因M4GFP转染PK细胞成功后，将带有增强型绿色荧光蛋白（M4GFP）报告基因的生长抑素基因疫苗C500（pGS/2SS-M4GFP-asd）免疫小鼠，12小时后开始宰杀试验组和对照组取器官进行荧光成像实验。预实验中实验组肝脏组织、脾脏组织、肾脏组织、肌肉组织在免疫后48h与对照组相比较出现特异性绿色荧光，表明目的蛋白可以在小鼠体内表达，且用绿色荧光蛋白标记生长抑素基因疫苗进行实时观察是可行的。
　　 3.组织表达。
　　 免疫后宰杀试验组和对照组小鼠取肝脏、肌肉和脾脏等组织器官制备冰冻切片，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因在组织器官中的表达情况。在荧光显微镜下可以观察到实验组与对照组肌肉、心脏、肝脏等组织中均出现绿色荧光，提示采用绿色荧光蛋白标记法检测目的基因在小鼠体内的表达，会受到体内自发荧光的影响，造成假阳性绿色荧光的出现。
　　 应用免疫组化方法，肌肉注射携带生长抑素质粒的减毒沙门氏菌后，小鼠肝脏组织、腿部肌纤维组织、脾脏组织在免疫后5d的组织化学切片中可见有特异性棕黄色阳性产物出现，说明减毒沙门氏菌作为载体能够将重组真核表达质粒带入小鼠内脏器官中，同时外源基因（SS）得到表达。
　　 本研究成功转化了生长抑素基因的真核表达载体，并证实以减毒沙门氏菌为载体的生长抑素基因疫苗免疫小鼠，可以在体内稳定表达，机体免疫后有望通过调控自身生长激素轴，从而达到改善生长性能的目的。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

声明

实验主要仪器

第一章 文献综述

第一节 生长抑素基因疫苗研究进展

1 生长抑素(SS)及其促生长作用

2生长抑素与机体免疫

第二节 减毒沙门氏菌作为口服DNA疫苗载体的研究进展

1减毒沙门氏菌进入机体免疫系统的可能机制

2携带DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答的机制

3携带DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌的应用及前景

第三节质粒-平衡致死系统的研究进展

1染色体-质粒平衡致死系统的概念

2以asd基因为标志的平衡致死系统

3染色体-质粒平衡致死系统在基因疫苗中的的应用

第四节 绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中研究进展

1 GFP的理化性质与发光机制

2绿色荧光蛋白标记的优点

3 GFP的应用

研究目的与意义

第二章 实验研究

第一部分 无抗性生长抑素DNA疫苗的体外表达

前言

1材料

2方法

3结果与分析

4讨论

第二部分 无抗性生长抑素DNA疫苗C500(PGS/2SS-M4GFP-ASD)在小鼠体内的表达与分布

前言

1材料

2方法

3结果与分析

4讨论

第三部分 无抗性生长抑素DNA疫苗对小鼠的免疫应答

1材料

2方法

3结果与分析

4讨论

全文实验小结

1总结

2特色与创新点

3下一步的工作

参考文献

致谢