调控几个脂肪酸合成关键基因对油菜种子芥酸含量的影响

摘要

油菜中的芥酸（erueic acid，C22：1）属于超长链脂肪酸（VLCFA），是一种重要化工原料，目前的主要提取来源是高芥酸油菜籽。编码延长酶的fae1基因是油菜芥酸合成途径上的关键基因。作为芥酸合成的底物，油酸的含量也与芥酸的含量密切相关，所以通过调控去饱和酶基因来控制油酸的积累量，也可间接的控制芥酸含量；编码去饱和酶的基因主要有2个，fad2及fad3。通过基因工程手段对这3个基因进行调控有可能较大幅度增加芥酸含量。
　　 本实验通过从高芥酸含量的甘蓝型油菜中获得fae1、fad2、fad3基因及种子特异启动子napin全长的编码序列，以pB1121为载体，NPTⅡ为选择标记基因，构建在种子中特异表达的fae1超表达建构、fad2及fad3反义和干涉建构，利用农杆菌介导的遗传转化导入拟南芥和油菜，以期获得芥酸含量提高的转基因植株。
　　 目前获得的拟南芥阳性转化植株已繁殖到T2代，经气相色谱法对脂肪酸组成进行分析，得出以下结论：
　　 （1）在fad2反义建构的转基因株系中，油酸，亚油酸，亚麻酸三种脂肪酸含量的平均值分别为13.93％，32.97％，19.69％（野生型的平均值分别为：9.70％，33.44％，24.09％）；在fad2干涉建构的转基因株系中，上述三种脂肪酸含量的平均值分别为13.94％，31.07％，19.61％。与野生型相比，两种建构对转基因植株均产生了油酸含量上升，亚油酸和亚麻酸含量下降的效果。
　　 （2）在fad3反义建构的转基因株系中，油酸，亚油酸，亚麻酸三种脂肪酸含量的平均值分别为13.58％，35.25％，17.59％（野生型的平均值分别为：9.70％，33.44％，24.09％）；在fad3干涉建构的转基因株系中，上述三种脂肪酸含量的平均值分别为12.04％，33.48％，18.13％，与野生型相比，两种建构对转基因植株均产生了油酸含量上升，亚麻酸含量下降的效果。
　　 在油菜中进行了fae1超表达和fad2反义建构的遗传转化，目前fae1超表达建构共获得阳性转化植株34株，其中T1代15株，T0代19株；fad2反义建构共获得T0代阳性转化植株42株。
　　 通过对fae1超表达阳性植株种子的脂肪酸含量测定，得出结论：在检测的27个株系中，共有17个株系的芥酸含量超过了野生型植株，其中有9个株系的芥酸含量高于55.00％，最高的达到了61.53％。表明fae1超表达建构对部分转基因植株能够起到提高芥酸含量的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

文献综述

1芥酸的用途和高芥酸育种

2植物种子中脂肪酸合成概述

3芥酸合成途径的研究

4 fae1基因的研究进展

5 fad2、fad3基因的研究进展

6超表达、反义、RNAi技术

7根癌农杆菌介导的油菜遗传转化

8利用基因工程提高芥酸含量的研究

本研究的目的及内容

材料与方法

1材料

1.1植物材料

1.2生化与分子生物学试剂

1.3菌株与质粒

1.4引物

2方法

2.1分子生物学基本方法

2.2植物表达载体的构建

2.3拟南芥的遗传转化及转基因种子筛选

2.4转基因种子GUS报告基因检测

2.5油菜的遗传转化及转基因植株鉴定

2.6油菜和拟南芥种子脂肪酸分析

结果与分析

1目标片段的克隆与载体构建

1.1油菜napin启动子克隆与GUS报告基因载体的构建

1.2 fae1基因的克隆与过表达载体的构建

1.3 fad2及fad3基因的克隆与载体构建

2转基因拟南芥植株的获得及分析

2.1阳性植株的筛选

2.2 napin的GUS报告基因检测

2.3种子脂肪酸分析

3转基因油菜植株的获得及分析

讨论

1启动子的选择探讨

2拟南芥遗传转化效率的探讨

参考文献

附录

致谢