贵州特色药用兰科植物杜鹃兰和独蒜兰共生真菌研究与应用

摘要

贵州道地中药材杜鹃兰、独蒜兰和云南独蒜组培技术已成熟，但组培苗移栽成活率低，生长缓慢，这阻碍其产业化，根据菌根真菌与兰科植物共生形成菌根的特点，本研究对三种兰科植物菌根真菌的动态变化特点、菌根真菌生理生化特性、菌根真菌的应用及分类鉴定进行了较为系统的研究。通过研究力图揭示兰科植物生长发育与菌根真菌的关系，建立科学合理的菌根真菌应用方法，为杜鹃兰和独蒜兰产业化奠定基础。主要研究结果及结论如下：
　　 1、建立了较为准确高效的兰科植物菌根真菌单菌丝团分离方法。
　　 该方法的建立解决了兰科植物菌根真菌分离中的一些关键问题，该方法使定量研究兰科植物菌根真菌的种类和数量的变化成为可能。
　　 2、揭示了菌根真菌动态变化特征及其与植物生长发育的关系
　　 利用新建立的单菌丝团分离方法，对三种兰科植物不同生长期、根中菌根真菌的纵向和横向变化的研究，发现植物根形成早期的优势菌生长快、气生菌丝发达，后期优势菌生长慢、气生菌丝不发达。根中菌根真菌由根尖向基部及由根表皮向内，生长快、气生菌丝发达的菌根真菌比例下降，生长较慢、气生菌丝不发达的菌根真菌比例增加。
　　 3、揭示了菌根真菌生理生化特征及其与植物生长发育的关系
　　 通过对三种兰科植物菌根真菌对不同碳源、氮源的利用能力，产B族维生素和赤霉素的能力、是否具有纤维素酶和多酚氧化酶酶活的研究，发现营养生长阶段的优势菌根真菌纤维素酶活较弱，多酚氧化酶活阳性或弱阳性，形成的B族维生素的量较高，淀粉、蔗糖、麦芽糖和无机氮的利用能力较强。生殖生长期优势菌纤维素酶活较强，多酚氧化酶活弱或无，形成的B族维生素的量低，对纤维素、淀粉和有机氮的利用能力强。
　　 4、从菌根营养的角度揭示了菌根真菌提高组培苗移栽成活率的内在原因，提出了“三个营养库”的假说和杜鹃兰组培苗移栽成功的“三个策略”
　　 通过对三种兰科植物菌根真菌与杜鹃兰各生长期的组培苗共培养，发现杜鹃兰各生长阶段的促生菌是此阶段的优势菌，同时发现不同生长期的组培苗移栽成活率不同，已分化根状茎、带根状茎的幼苗、带球茎的幼苗成活率高，而无根状茎或球茎的幼苗移栽成活率低，同时发现菌根真菌在组培苗移栽过程中主要起保护根及提高根的活力的作用。
　　 据于此提出了杜鹃兰组培苗移栽成活密切相关的“三个营养库”的假说，即根状茎、叶片和球茎，组培苗移栽成功就在于成功实现“根状茎营养库”到“叶片光合营养库”，再到“球茎营养库”的转变；并以此为指导，总结出杜鹃兰组培苗移栽成功的“三个策略”，即选择根状茎、带根状茎的分化苗或带球茎的分化苗，进行菌根化育苗，利用菌根真菌的保根作用、根状茎和球茎的营养库作用，使组培苗成功实现向“光合营养库”的转变，并最终建立可顺利渡过休眠期的“球茎营养库”。
　　 5、建立了菌根真菌应用于组培苗移栽的模型
　　 通过总结兰科植物菌根真菌动态变化特点、菌根真菌生理生化特性、兰科植物本身特性等的研究结果，形成了兰科植物菌根真菌应用于组培苗移栽的模型：选择带有营养贮存器官的兰科植物组培苗与根形成早期的优势菌根真菌，进行菌根化培养，促进生根及提供菌根营养；待共生关系形成并建立了稳定的光合作用后，施用营养生长期优势菌，促进兰科植物光合产物转化贮存和保持根的高活力，实现兰科植物组培苗的成功栽培。
　　 6、完成三种兰科植物菌根真菌的分类鉴定
　　 采用形态鉴定、酶活特性测定和ITS序列系统发育分析方法，完成三种兰科植物菌根真菌的分类鉴定，较为系统地提出了兰科植物共生丝核菌的分类鉴定方法及相关属种的分类检索表，并发现Epulorhiza属中的第三个种群，即未定名的新属New genus，该属的最大特点是生长很慢、菌落边缘不整齐、不形成或形成形状不规则的念珠状细胞，淀粉利用能力强，是兰科植物光合产物贮存、转化及利用相关的重要菌根真菌之一。
　　 研究中提出的“三个营养库”的假说，将丰富兰科植物菌植共生理论；提出的兰科植物共生丝核菌的分类方法、相关属种检索表、提出的新属，将丰富兰科植物共生丝核菌的分类鉴定体系。本研究建立的单菌丝团分离方法、提出的杜鹃兰组培苗移栽的“三个策略”及建立菌根真菌应用于组培苗移栽的模型，为实现杜鹃兰、独蒜兰和云南独蒜兰组培苗的成功移栽，实现其产业化提供理论和技术支撑。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

前言

1兰科植物菌根真菌的分离培养方法

1.1根组织表面消毒分离法

1.2单菌丝团分离技术

1.3种子和根状茎(或原球茎)套袋原生地(in situ)播种诱捕法

1.4种子和根状茎(或原球茎)套袋非原生地(ex situ)播种诱捕法

2兰科植物菌根真菌的种类及分类

2.1丝核菌类的种类及分类鉴定

2.2具有丝核菌阶段的担子菌的种类及分类鉴定

2.3无丝核菌阶段的担子菌

2.4不育菌丝群(Mycelium radicis atrovirem，MRA)

2.5其他分离物

3菌根真菌与兰科植物生长发育的关系

3.1促进种子萌发及幼苗生长

3.2促进成年植株生长发育

3.3兰科植物菌根真菌作用的特异性问题

4兰科植物及其菌根真菌与共生相关的生理生化特性

4.1兰科植物及其菌根真菌共生关系形成及维持过程中的对抗特性

4.2兰科植物及其菌根真菌的互利营养特性

4.3兰科植物及其菌根真菌的生理生化特性在组培苗菌根化中的应用

5研究的目的和意义

第一章菌根真菌单菌丝团分离方法的建立

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1不同孵育条件对菌丝团萌发生长率的影响

2.2不同孵育条件对菌根真菌分离种类的影响

2.3影响菌丝团萌发生长率的内在因素及选择根的正确方法

3结论和讨论

3.1可以较好地分离生长慢的菌根真菌

3.2可以分离获得更多种类的菌根真菌

3.3新方法的分离效率高

3.4新方法可从含有多种菌的单个菌丝团中将各种菌分离出来

3.5新方法对兰科植物菌根真菌研究及应用的价值

第二章菌根真菌动态变化特点研究及其对兰科植物生长发育的影响

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1三种兰科植物菌根结构特点

2.2兰科植物菌根真菌在根中的分布

2.3不同根龄根中菌丝团萌发生长率，可培养菌丝团率

2.4不同根龄根中菌根真菌种类及数量

2.5不同植株同一根龄根中菌根真菌的种类

2.6云南独蒜兰同一根不同部位菌根真菌的种类

2.7杜鹃兰同一根不同部位菌根真菌的分布特点

2.8独蒜兰同一根不同部位菌根真菌的种类

3结论和讨论

3.1兰科植物菌根真菌侵入方式及途径

3.2兰科植物菌根真菌的不同生长期动态变化特点

3.3老根中菌根真菌的纵向分布变化特点

3.4老根中菌根真菌的横向分布变化特点

第三章菌根真菌生理生化特性及其与植物生长发育的关系

1材料与方法

1.1菌根真菌纤维素酶活测定试验材料及方法

1.2菌根真菌多酚氧化酶酶活测定试验材料及方法

1.3菌根真菌碳源试验材料与方法

1.4菌根真菌氮源试验材料方法

1.5菌根真菌产B族维生素和赤霉素检测试验方法

1.6用到的菌株及编号

2结果与分析

2.1菌根真菌纤维素酶活试验研究

2.2菌根真菌多酚氧化酶酶活试验研究

2.3菌根真菌碳源试验研究

2.4菌根真菌氮源试验研究

2.5菌根真菌产B族维生素和赤霉素检测

3结论和讨论

3.1三种兰科植物共生真菌对不同碳源利用特点

3.2三种兰科植物菌根真菌对氮源的利用特点

3.3三种兰科植物不同生长阶段丝核菌类菌根真菌生理生化特征及其对兰科植物生长发育的影响

第四章菌根真菌的应用

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1实验室分化和未分化杜鹃兰根状茎与菌根真菌共培养

2.2不同生长阶段的组培苗在大棚蛭石中与各种菌根真菌共培养

2.3杜鹃兰菌根真菌菌丝及发酵液伴栽根状茎的比较

3结论和讨论

3.1菌根真菌对光合兰科植物生长发育的作用

3.2杜鹃兰三个营养库与菌植共生关系的形成

3.3杜鹃兰菌根真菌应用于生产的策略

第五章杜鹃兰、独蒜兰和云南独蒜兰菌根真菌分类鉴定

1材料与方法

1.1经典分类材料与方法

1.2隔膜超微结构观察及鉴定方法

1.3 ITS序列分析方法

2结果与分析

2.1云南独蒜兰菌根真菌鉴定

2.2独蒜兰菌根真菌鉴定

2.3杜鹃兰菌根真菌鉴定

3结论和讨论

3.1 兰科植物共生丝核菌的分类鉴定方法

3.2 兰科植物丝核菌类菌根真菌的特异性

3.3 兰科植物不同生长期菌根真菌种类的动态变化特点

第六章主要研究结果

1本研究的创新点

1.1建立了准确高效兰科植物菌根真菌单菌丝团分离方法

1.2建立了菌根真菌应用于组培苗移栽的新模型

1.3提出了兰科植物菌根真菌的分类方法和相关属种的分类检索表

2本研究的主要结果

2.1揭示了兰科植物菌根真菌的动态变化特点

2.2揭示了兰科植物不同生长期优势菌根真菌生理生化特性

2.3揭示了菌植共培养过程中组培苗移栽成功的关键

3本研究的提出的假说及兰科植物菌根真菌应用策略

3.1提出了杜鹃兰三个“营养库”假说

3.2提出了菌根真菌应用于杜鹃兰不同生长期组培苗移栽的策略

4本研究中的缺陷及值得研究的方向

参考文献

附表

致谢

攻读博士期间申报专利及发表文章情况