反式二羟环氧苯并（a）芘高表达相关基因及其主要特性研究

摘要

苯并(a)芘(B[a]P)是一种广泛存在的环境污染物，系多环芳烃(PAHs)的代表物，在空气、土壤、水及食物中均有它的存在。PAHs由有机物质的高温分解和不完全燃烧形成，也可由人类生产和生活活动产生以及自然生成。PAHs进入哺乳动物细胞后活化为高毒性的活性代谢中间物并可对细胞大分子(DNA，蛋白质，脂质)造成不可逆的损伤。PAHs代表一类有毒化合物，能在体内产生许多毒性反应，包括细胞毒性、遗传毒性、免疫毒性、致畸性、致癌性和神经毒性等。关于BaP的致癌性资料，主要来自流行病学研究和动物实验研究，但人类方面尚缺乏有力的证据，因此，在WHO属下的国际癌症研究机构在其公布的致癌因素清单中，将之归入“对人类可能有致癌性”的一类因素中。故BaP对人类致癌性的证据有待充实，其致癌机制尤其是分子机制有待阐明。已知Bap可使某些原癌基因激活和抑癌基因失活，但这些变化并不具特异性，因为不少化学物质对这些基因都具有类似作用，因而难以阐明BaP致癌代谢物BPDE的特异易感基因。因此，本文在从基因组水平上的筛选→已知基因功能研究→未知基因全长克隆等方面对BPDE致癌的相关基因进行研究，为寻找环境致癌物的生物性标志提供依据，为肿瘤的基因预防、早期诊断提供理论与技术基础，为探索抗肿瘤分子生物学治疗手段提供新的策略与途径。现将结果报告如下： 本文有三部分组成：第一部分反式二羟环氧苯并(a)芘诱导的转化和成瘤16HBE细胞基因的表达改变 目的：多环芳烃是环境中广泛存在的污染物，苯并(a)芘(B[a]P)一直作为致癌剂多环芳烃(PAH)的代表，反式-7，8-二羟-9，10-环氧苯并芘(反式-BPDE)可能是B[a]P的终致突变物和终致癌物，尽管己进行过一些研究，但其致癌的分子机制特别是相关敏感基因的研究仍不十分清楚，本研究以筛选反式-BPDE诱导转化16HBE细胞以及成瘤16HBE细胞的差异表达基因，为其致癌的分子机制研究及生物性标志的筛选提供依据。 方法：分别以BPDE转化和成瘤16HBE细胞cDNA为检测子(tester)，正常16HBE细胞cDNA为驱动子(driver)，应用抑制性消减杂交方法构建cDNA消减文库，经2次消减杂交和2次PCR后，将巢式PCR产物插入TA载体克隆，随机挑选克隆进行鉴定和测序，并用斑点杂交法验证序列的同源性，将所得序列进行GenBank的BLAST和生物信息学分析。 结果：抑制性消减杂交试验结果的电泳图显示消减组有明显的条带富集，未消减组看不到明显的条带，说明消减组有差异表达基因被扩增。将这些差异表达的基因克隆、测序、分析后，在BPDE转化细胞中发现了7个高表达的基因，为翻译延长因子1α1、线粒体基因、溶解物载体家族25、EphA2、酪氨酸-3-加单氧酶/色氨酸-5-加单氧酶活化蛋白、乳酸脱氢酶A、TRIM28等，尚有一条在GenBank的已知基因中找不到对应序列，在EST序列中找到全长对应序列；在成瘤细胞中有8条已知的基因高表达，它们是：真核生物翻译延长因子1α1，HIF-1反应性RTP801，核糖体蛋白L10(RPL10)，核糖体蛋白S29(RPS29)，线粒体相关的几个基因，层粘连蛋白受体1(67LR1)，其一致性均达到99％以上；另有2条差异表达的cDNA片断在已知基因中未找到对应序列，在EST中找到对应序列。 结论：初步筛选了在转化和成瘤16HBE细胞中高表达的基因，为其功能的进一步研究提供了基础资料；发现的高表达基因可能在BPDE的转化和致癌机制中起作用，另外，可能有未知基因与BPDE的转化和成瘤作用有关，为新基因的全长克隆和功能研究提供了基础资料。 第二部分反式二羟环氧苯并(a)芘高表达相关基因67LR1和eTEF1α1的主要特性研究 目的：67LR1及eTEF1α1基因是在第一部分研究的基础上，筛选出的与反式-BPDE相关的基因，虽然已进行过一些研究，但其在致癌机制中所起的作用仍不清楚，本部分是为了探讨67LR1及eTEF1α1基因在反式-BPDE转化及致癌机制中的作用，为反式-BPDE相关基因的功能研究及其恶性转化的生物性标志的筛选提供依据。 方法：从GenBank调出67LR1及eTEF1α1基因全长，设计引物，采用RT-PCR方法扩增67LR1和eTEF1α1基因全长，插入pcDNATM3.1DirectionalTOPO表达载体，以脂质体转染介导的技术和/或G418细胞筛选法转染16HBE细胞，构建转基因67LR1和eTEF1α1的瞬时和(或)稳定表达的细胞株。用半定量RT-PCR方法分析转基因表达产物，对瞬时转染的转基因67LR1细胞株，应用含8064个基因点的微芯公司基因表达谱芯片CSC-GE-80与双荧光标记样品与芯片杂交和扫描、图像数据分析等一系列处理进行表达谱分析；对稳定转染67LR1和eTEF1α1基因的细胞株，进行了双层软琼脂试验，并对转基因67LR1的细胞株进行了裸鼠接种试验。 结果：成功扩增出67LR1和eTEF1α1基因全长，构建出瞬时和(或)稳定表达67LR1和eTEF1α1的细胞株。对瞬时转染的转基因67LR1细胞株的表达谱分析，两组相比发生了显著性表达变化的基因有295个，其中表现为上调的基因有145个，下调表达的基因有150个。在发生了显著性表达改变的基因中，比较有明显功能分类特征的包括与信号转导相关的基因，与肿瘤相关的基因，与免疫反应相关的基因以及与蛋白质合成系统相关的基因等。稳定转染67LR1和eTEF1α1基因的细胞株，均能在双层软琼脂中形成克隆。转基因67LR1的细胞株在本次实验中尚不能使裸鼠成瘤。 结论：67LR1基因功能涉及到信号转导，肿瘤相关基因等方面，相关基因的表达变化具有复杂性，复杂的信号传导网络的紊乱与Ras通路有关。eTEF1α1和67LR1均与反式-BPDE的恶性转化有关，提示67LR1和eTEF1α1基因作为反式-BPDE恶性转化的生物性标志的可能性，亦提示将67LR1和eTEF1α1作为肿瘤化学预防和治疗的靶分子的可能性。 第三部分反式二羟环氧苯并(a)芘相关新基因brg的全长克隆 目的：在第一部分的研究中，发现16HBE-C细胞表达变化的基因中有未知基因参与(EST)，因其与BPDE有关，所以命名为brg(anti-BPDErelatedgene)基因。本研究应用cDNA末端快速扩增法(rapidamplificationofcDNAends，RACE)扩增此未知基因的全长，以进行下一步的基因功能研究。 方法：应用cDNA末端快速扩增法(RACE技术)，对3’和5’端分别设计了梯度PCR，巢式PCR等优化程序，以获得特异的产物，然后对特异产物直接测序，将测序结果进行生物信息学分析，基因拼接等获得新基因brg全长。 结果：用RACE方法，经优化后的程序，3’和5’端均成功获得特异性产物，3’RACE测序为394bp，有明显的PolyA加尾信号，有编码区的终止密码子；5’RACE测序为1017bp，有起始密码子ATG，其中197bp为3’和5’全长共有序列。将3’和5’序列拼接，结果全长1214bp，生物信息学分析brg基因阅读框1032bp，编码344个氨基酸。 结论：所得结果与设计一致，说明这一技术路线是简便可行的，brg基因可能在反式二羟环氧苯并(a)芘的致癌机制中起重要重作用。

目录

论文说明：缩略语Abbreviations

第一部分：反式二羟环氧苯并(a)芘诱导的转化和成瘤16HBE细胞基因的表达改变

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分：反式二羟环氧苯并(a)芘高表达相关基因67LR1和eTEF1α1的主要特性研究

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第三部分：反式二羟环氧苯并(a)芘相关新基因brg的全长克隆

1材料与方法

2结果

讨论

参考文献

总结

综述 多环芳烃致癌的分子毒理学研究进展

附录一彩图

附录二博士在读期间发表论文目录

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