猪肠球菌病病原分离鉴定及其分子致病机制研究

摘要

肠球菌为球形或卵圆形、呈链状排列的革兰阳性细菌。自从1984年从链球菌属中分离出来单独成属以来，其成员已由原来的2个种增加到41个种。肠球菌不但可引起住院病人的腹膜炎、心内膜炎、尿道炎和脑膜炎等，也可引起猪、羊、鸡和鸭等动物的感染。感染动物的肠球菌可直接传染给人，而食品中污染的肠球菌可导致人的食物中毒，因此肠球菌在公共卫生学上具有重要的意义。2003～2008年期间，我们在河南省许昌、南阳、郑州、洛阳等地送检的病死猪分离出43株疑似肠球菌的病原性细菌，该些细菌主要引起患猪败血症、脑膜炎和关节炎。对其进行了常规的形态学观察、耐受性试验、Vitek-32生化鉴定和全细胞蛋白型分析，并做了16SrRNA和RAPD等分子水平的研究。在此基础上，调查了各分离株的毒力基因携带情况，并建立了小鼠腹膜炎模型，进一步比较了毒力基因、毒力表型和抗生素抗性与分离菌的致病性关系，以期为研究细菌致病机制、猪感染的流行病学以至最终的预防和控制提供参考依据。
　　 细菌学检验结果表明，所有的分离菌均呈G+，卵圆形或球形，并呈长短不一的链状排列，能够在6.5％NaCl肉汤、pH9.6葡萄糖肉汤和10℃、45℃和60℃30min条件下生长。Vitek-32全白动细菌鉴定系统仅成功鉴定出了43个分离株中的35株，分别为粪肠球菌(E.faecalis)11株、屎肠球菌（E.faecium）2株、铅黄肠球菌（E.casseliflavus）22株，另有8个分离菌株未能鉴定到种的水平。细菌全细胞蛋白型分析结果与Vitek-32有明显不同，43株分离菌全细胞蛋白条带的分子量差异主要在97KDa、90KDa、67KDa和46KDa处，其中具有蛋白分子量90KDa条带的菌株有13个，与参考菌株ATCC29212和ATCC33186相似；而其余的菌株均具有46KDa、67KDa和97KDa3个条带，故认为它们是另外一种不同于粪肠球菌的肠球菌种类。
　　 16SrRNA基因序列分析结果表明，43株肠球菌的16SrRNA序列与GenBank中登录的各种肠球菌同源性均较高。经利用DNAStar软件将感染猪的疑似肠球菌分离株与GenBank中32种肠球菌的16SrRNA序列进行序列同源性分析，所有43个分离株均被鉴定到种的水平，其中13株与GenBank中登录的4株粪肠球菌(Efaecalis)模式菌株AF515223、AJ301831、EU728747、NC_004668的同源性在99.3％～99.9％之间；而另30个分离株除HE25之外均与GenBank中登录的3株屎肠球菌（Efaecium）模式菌株EU547780、DO411813、Y18294的同源性在99.3％～100％之间；HN-25与其余29个屎肠球菌菌株的同源性在99％～99.4％之间。所测定的42株肠球菌(HN-N1～HN-N42)16SrRNA序列已被GenBank收录，其登录序列号依次为FJ378656～FJ378697。
　　 合成了19条随机引物对肠球菌基因组DNA多态性进行分析，以从基因组水平上进一步验证鉴定的正确性，并通过分析各菌株亲缘关系为肠球菌的流行病学积累资料。结果显示4条引物对所有菌株均扩增出了多态性较好的条带，通过SPSS11.5软件计算其相似性系数，发现HN-3和HN-6菌株间遗传距离指数为0.000，可能为同源菌株，其他菌株亲缘关系则较远。在聚类分析中，聚类重新标定距离(rescaled distance cluster combine)为21时，具有鉴定肠球菌至种水平的能力，试验的肠球菌菌株聚类成4大类群，分别为类肠球菌聚类群、屎肠球菌聚类群、鸟肠球菌聚类群和仅有HN-25菌株聚类群。在类肠球菌聚类分析中，聚类重新标定距离为19时，可将试验的类肠球菌分成4个聚类群；而屎肠球菌在聚类重新标定距离为19时，则分成2个聚类群，除HN-25菌株为一聚类群外，其他屎肠球菌形成一个大的聚类群。
　　 为了研究肠球菌致病机制，通过调查猪临床菌株、肉品菌株和猪粪便菌株12种毒力基因携带情况，发现粪肠球菌较屎肠球菌携带更多的毒力基因(7.83：3.73)；而3种来源的肠球菌中以临床菌株毒力基因最多，其次是肉品菌株，粪便菌株携带毒力基因最少。临床粪肠球菌分离株中毒力基因gelE、efaA和sprE的检出率为100％，ace、cylA和esp的检出率分别达到84.6％、84.6％和69.2％，均明显高于其他来源的菌株；而在临床屎肠球菌菌株中，cylA和gelE的检出率分别为83.3％和66.7％，也明显比其他来源的高。
　　 在小鼠腹膜炎模型中，粪肠球菌均比屎肠球菌致病性强，而在试验的粪肠球菌中，各菌株的致病性也不相同，其中，以HN-41的致病性最强，其LD50为106.01/ml，而HN-1致病性最弱，其LD50为107.01。屎肠球菌HN-32也较HN-15的LD50高。通过分析各菌株的毒力基因、毒力表型和抗生素抗性与致病性关系时发现，致病性的大小与毒力基因携带多少成正相关，gelE、cylA、ace和esp等毒力基因对致病性影响较大；毒力表型与致病性大小关系与肠球菌种有关，同种肠球菌中，β溶血性表型比明胶溶解表型与致病性大小更密切；肠球菌耐药种类多少与其致病性关系不明显。