转TaEDR1反义基因抗白粉病小麦的选育

摘要

由白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speer f.sp.tritici Em.Marchal,Bgt)引起的白粉病是严重危害小友(Triticum aestivum L.)生产的世界性病害。随着抗病分子生物学的发展,小麦抗白粉病相关基因的克隆研究进展很快。研究小麦抗病分子机理,了解抗病信号传导途径,发掘信号途径中的关键调控基因将为转基因抗病小麦的选育奠定理论和物质基础。本研究参考拟南芥抗病分子机理研究结果,通过RACE技术克隆了一个推测的小麦抗病负调控基因TaEDR1,用抑制基因表达技术将目标基因的一个反向片段插入到双元表达载体中,转入高产小麦品种‘周麦18’,获得了转基因植株。具体研究结果如下:
　　 1、TaEDR1基因的克隆和鉴定。用RACE技术对经白粉菌诱导24 h的小麦-黑麦1BL/1RS易位系99/2439叶片的cDNA进行扩增,获得了与大麦HvEDR1基因高度同源的小麦基因全长cDNA克隆(GenBank登录号:AY743662),命名为TaEDR1基因。TaEDR1基因cDNA全长3050 bp,编码959个氨基酸组成的多肽。高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化功能域存在于TaEDR1的羧基末端。首次提供了证明普通小麦中存在EDR1基因同源物的分子证据。利用半定量RT-PCR技术,研究了TaEDR1基因的表达,发现该基因在白粉菌诱导后的叶片中表达有所增强,在叶、穗、茎、根中均有表达。
　　 2、反义TaEDR1基因表达载体的构建。把TaEDR1基因编码N-端区域的片段反向插入到表达载体pAHC25中,构建成反义RNA植物表达载体。通过PCR技术用加有舣酶切位点的一对特异性引物扩增连接有目的基因的表达载体pCAMBIA-1301/220U-anti-TaEDR1,同时酶切扩增产物和表达载体pAHC25分别得剑TaEDR1基因片段和pAHC25载体片段,将TaEDR1基因片段反向插入到pAHC25表达载体的单子叶植物高效启动子Ubi的卜游和终止子nos3上游。表达载体保存于大肠杆菌DH5a中。
　　 3、转基因植株的获得。利用花粉管通道法,将表达载体pAHC25-anti2-TaEDR1导入小麦高产品种‘周麦18’,获得T0代转基因种子。通过对T0代植株的幼苗进行PPT抗性筛选以及PCR鉴定,最后获得了9株目的基因及nos终止子均呈PCR阳性的转基因植株；通过大田白粉菌抗性鉴定,共获得36株抗性比对照明显提高的转基因植株,其中分子检测呈阳性的有23株。