L1插入序列对GFP报告基因表达的影响

摘要

目的 基因组测序发现，在哺乳动物的基因组中，单拷贝基因内和基因之间散布着大量的转座子，这些转座子曾经被认为是无用的“垃圾序列”。这些转座子中最有代表性的就是LINE-1(long interspersed nuclear elements 1，长散布重复序列1，简称L1)。L1是人类基因组中含量最多的自主性逆转录转座子，约占人类基因组DNA的17％。哺乳动物基因组中约1/3的成分都直接或间接跟L1逆转录转座有关。L1有2个开放读码框(opened reading flame)，编码2种蛋白质：ORF1——编码的蛋白有RNA结合活性，ORF2——编码的蛋白有核酸内切酶和逆转录酶两种活性，2种蛋白都是L1转座所必需的。迄今为止已发现L1与多种生物学现象关联，包括基因突变， X染色体失活，基因重排，基因表达沉默，肿瘤发生，生物进化等。在机体免疫系统中，T细胞和B细胞抗原受体等位基因排斥，IL-2、IL-4的基因表达都与L1有关。 最近，已有研究表明：L1序列能够下调基因的表达——Hart将L1.2的ORF2(L1重复序列的一部分)和LacZ分别插入到GFP报告基因下游。与插入LacZ的序列比较，ORF2显著减少GFP蛋白质的产生，使GFP的RNA生成量减少70倍。当改变下游插入片段ORF2的读码框时，GFP的表达仍然受到相同的抑制作用。Han同时还观察到，插入反义ORF2也抑制GFP RNA和GFP蛋白质的产生，但是作用较弱。 已知L1有10个家族，根据其ORF2和3'非翻译区同源性进行分类，这10个家族又可以分为75种亚家族，各个亚家族之间存在序列上的差异。因此，上述L1序列下调基因表达的结果是否对其它L1亚家族也是如此，尚未得知。更兼最近还有文献报道，在GFP-L1转基因小鼠中，GFP报告基因可以在小鼠睾丸中表达，但是在其它组织不表达，很明显L1成分参与调控基因表达在不同的细胞中也不相同。因此，有必要研究L1序列参与调控基因表达的不同影响因素。 为此，本文拟用L1PA3(L1序列的一个亚家族)序列上的ORF2为研究对象，从ORF2调节基因表达的角度出发，揭示L1序列调控基因表达的影响因素，为进一步探讨L1下调基因表达的潜在机制，提供实验依据。 方法 1 按照引物设计原则，设计目的序列的引物，采用PCR技术，扩增目的序列作为插入片段。在引物中加入合适的酶切位点，根据实验需要采用双酶切或单酶切。 2 选择pEGFP-C1作为载体，先将载体和插入片段用相同的限制性内切酶酶切，然后用T4 DNA连接酶连接。转化DH5α菌株，PCR法筛选阳性克隆，进一步用酶切和测序鉴定。 3 用Lipofectamine<'TM>2000将重组质粒瞬时转染HeLa细胞。荧光显微镜下计数GFP荧光阳性细胞数，在白光下计数同样视野的细胞总数(每个样本至少500个)，计算荧光阳性细胞百分率。在白光和荧光下分别对同一视野照相。 结果 1 重组质粒鉴定将PCR扩增的ORF2正、反序列插入pEGFP-C1质粒，经限制性内切酶(Xho Ⅰ和PstⅠ)消化鉴定和测序分析，成功构建了重组质粒P-ORF2，P-ORF2as。 将PCR扩增的LacZ正、反序列插入pEGFP-C1质粒，经限制性内切酶(Xho Ⅰ和Pst Ⅰ)消化鉴定和测序分析，成功构建了重组质粒p-LacZ，P-LacZas。 将PCR扩增的ORF2/A(Apa Ⅰ酶切)和ORF2/Am(ApaⅠ酶切，读码框改变)的反序插入pEGFP-C1质粒，经过测序分析，成功构建了重组质粒p-ORF2as/A，p-ORF2as/Am。 将PCR扩增的SV40 polyA反序插入p-ORF2as/Am质粒ORF2as/Am片段上游的Pst Ⅰ酶切位点，经过测序分析，成功构建了重组质粒p-Aas-ORF2as/Am。 2 插入ORF2和LacZ正、反序对GFP基因表达的影响在pEGFP-C1质粒GFP基因下游按正、反方向插入ORF2和LacZ，共有p-ORF2，p-ORF2as，p-LacZ，p-LacZas四种重组质粒，用pEGFP-C1作为对照，转染HeLa细胞，荧光显微镜观察，转染细胞的荧光细胞阳性率为： p-ORF2(0.53±0.10)％ p-ORF2as(2.28±0.66)％ p-LacZ(1.82±0.3 1)％ p-LacZas(1.07±0.33)％ pEGFP-C1(23.88±0.93)％ 3 插入ORF2as/A，ORF2as/Am及polyAas-ORF2as/Am对GFP基因表达的影响以ORF2as为主要研究对象，先将改变酶切位点的ORF2as/A片段插入pEGFP-C1质粒GFP基因下游，构建p-ORF2as/A。再改变ORF2as/A片段的读码框，构建p-ORF2as/Am。最后在ORF2as/Am上游插一段polyAas，构建p-Aas-ORF2as/Am。连同p-ORF2as、pEGFP-C1共5种质粒，转染HeLa细胞，荧光显微镜观察，转染细胞的荧光细胞阳性率为： p-ORF2as(2.5±0.92)％ P-ORF2as/A(10.6±0.65)％ p-ORF2as/Am(0.39±0.10)％ p-Aas-ORF2as/Am(12.53±0.87)％ pEGFP-C1(24.13±1.43)％ 4 荧光表达分析 (1)p-ORF2(0.53±0.10)％，p-ORF2as(2.28±0.66)％，p-LacZ(1.82±0.31)％和p-LacZas(1.07±0.33)％的荧光细胞阳性率明显低于对照pEGFP-C1(23.88±0.93)％的荧光细胞阳性率(P<0.01)。 (2)转染p-ORF2(0.53±0.10)％的荧光细胞阳性率明显低于p-ORF2as(2.28±0.66)％，p-LacZ(1.82±0.3 1)％和p-LacZas(1.07±0.33)％的荧光细胞阳性率(P<0.05)。 (3)转染p-ORF2as/A(10.6±0.65)％的HeLa细胞荧光阳性率高于p-ORF2as(2.5±0.92)％的荧光阳性率(P<0.01)。 (4)转染p-ORF2as/Am(0.39±0.10)％的HeLa细胞荧光阳性率明显低于p-ORF2as/A(10.6±0.65)％的荧光阳性率(P<0.01)。 (5)转染p-Aas-ORF2as/Am(12.53±0.87)％的HeLa细胞荧光阳性率明显高于p-ORF2as/Am(0.39±0.10)％的荧光阳性率(P<0.01)。 结论 1 在pEGFP-C1质粒的GFP基因下游插入片段大小相同，但序列不同的DNA片段时，均能抑制上游GFP基因的表达，且不同序列抑制作用的强弱不同，ORF2正序抑制作用最强。 2 相同的ORF2as片段插入到GFP下游的不同酶切位点，对GFP的抑制作用不相同。 3 ORF2as片段插入pEGFP-C1质粒的同一个酶切位点，读码框改变后，GFP基因的表达不同。 4 SV40polyA反向插入到改变读码框的ORF2as上游时，可以部分解除ORF2as对GFP基因的抑制作用。

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前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 哺乳动物逆转录转座子LINE-1研究进展

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