化湿行瘀清热方剂对口腔扁平苔藓患者唾液中差异蛋白的影响

摘要

目的：口腔扁平苔藓(Oral Lichen Planus，OLP)是一种受到免疫因素、感染因素、心理因素等多因素相互作用的口腔黏膜慢性炎症性疾病，主要累及口腔颊、舌及牙龈等部位的黏膜。该病顽固难治并具恶变倾向，世界卫生组织将其列为癌前状态。其主要的临床表征为白色病损、糜烂及疼痛，严重者可影响患者的生活质量。因此，对于 OLP的早期诊断与治疗显得尤为重要。迄今为止，国内外学者提出了很多治疗 OLP的方法，主要包括药物治疗、手术治疗、物理治疗等，但西药多以局部、全身应用皮质激素或免疫调节剂来改善症状，常因出现较严重的副作用而停止用药。近年来中医中药治疗 OLP越来越受到重视并显示出优越性。在临床上我们发现化湿行瘀清热方剂对 OLP有较好的临床疗效，然而其确切的作用机制并不十分清楚。本研究采用双向荧光差异凝胶电泳技术（two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2-D DIGE）和液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）筛选鉴定化湿行瘀清热方剂治疗OLP前后唾液中的差异蛋白，并通过蛋白质印迹法（Western-blot）进一步检测差异蛋白的变化情况，为OLP可能的发病机制及化湿行瘀清热方剂的临床应用提供理论依据。
　　方法：
　　1.应用双向荧光差异凝胶电泳和液相色谱-质谱联用技术筛选鉴定OLP患者治疗前后唾液中的差异蛋白
　　选取6例OLP患者为研究对象，分别收集治疗前和经化湿行瘀清热方剂治疗8周后的唾液标本，按照2D-clean up（GE公司）试剂盒说明书操作步骤提取唾液总蛋白，Brandford法测蛋白浓度，精确蛋白上样量。采用双向荧光差异凝胶电泳分离蛋白质，经Typhoon9410扫描成像。通过DecyderTM2D6.5版差异分析软件搜索差异点，标记差异表达量大于1.2倍的蛋白质点，然后用Ettan Spot Picker切下差异蛋白点。应用液相色谱-质谱联用技术筛选鉴定差异蛋白。
　　2.蛋白免疫印迹法检测差异蛋白
　　收集30例OLP患者经化湿行瘀清热方剂治疗前后的唾液蛋白。为验证并进一步检测治疗对差异蛋白含量的影响，选择筛选出来的 OLP治疗前后唾液差异蛋白中高表达的分泌型IgA、血清白蛋白、IgM、碳酸酐酶6、锌α2糖蛋白进行蛋白免疫印迹法检测，即行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，用半干转移法转移蛋白，经目的蛋白抗体孵育后在Alpha innotech上扫描，曝光，获取目的蛋白条带图像，用QuantityOne软件检测目的蛋白条带灰度值，通过SPSS13.0行数据分析。
　　结果：
　　1.双向荧光差异凝胶电泳:OLP患者治疗前后唾液中表达程度相同的蛋白在双向荧光差异凝胶电泳图像中呈现黄色，唾液中有差异性的高表达蛋白呈现红色或绿色。DecyderTM2D6.5软件及液相色谱-质谱联用技术分析筛选出治疗前后均同时存在但表达有差异的蛋白质点。Bioworks Browser3.3.1软件在蛋白数据库（NCBI human fasta数据2013.12.10）中搜索鉴定差异蛋白为：分泌型IgA、血清白蛋白、IgM、碳酸酐酶6、锌α2糖蛋白和唾液淀粉酶；
　　2.蛋白印迹法：OLP治疗前后唾液差异蛋白的变化情况，选择高表达的分泌型IgA、血清白蛋白、IgM、碳酸酐酶6和锌α2糖蛋白行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，图像清晰，没有明显蛋白丢失和降解。在Alpha innotech上扫描获取目的蛋白条带图像，条带清楚。经检测分泌型IgA、血清白蛋白、IgM、碳酸酐酶6、锌α2糖蛋白在OLP治疗前后均有表达，但表达强度不同。免疫球蛋白M、碳酸酐酶6、锌α2糖蛋白及血清白蛋白治疗后较治疗前表达水平下降，而免疫球蛋白 A的表达水平较治疗前明显升高。差异均有统计学意义。
　　结论：
　　1.应用双向荧光差异凝胶电泳和液相色谱-质谱联用技术筛选鉴定出OLP中高表达的差异蛋白：免疫球蛋白M、碳酸酐酶6、锌α2糖蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白A和唾液淀粉酶；
　　2.化湿行瘀清热方剂治疗OLP后较治疗前免疫球蛋白M、碳酸酐酶6、锌α2糖蛋白及血清白蛋白表达水平下降，分泌型IgA表达水平升高。免疫球蛋白M、碳酸酐酶6、锌α2糖蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的表达可能在OLP的发生发展中起着重要作用。
　　3.分泌型IgA为OLP患者唾液中表达稳定且重复性好的差异蛋白。可考虑作为OLP患者唾液蛋白研究中的生物标记。

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前言

材料与方法

1材料

1.1临床资料

1.2标本采集

1.3化湿行瘀清热方剂:

2试剂和仪器

2.1主要试剂

2.2主要仪器：

3方法

3.1溶液配制

3.2实验步骤

4统计学方法

结果

1 双向荧光差异凝胶电泳

2 蛋白质免疫印迹结果

附图

讨论

1唾液差异蛋白组学

2化湿行瘀清热方剂治疗OLP前后唾液中的差异蛋白

结论

参考文献

综述：口腔扁平苔藓治疗方法的进展研究

致谢

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