口腔扁平苔藓动物模型的初步建立及化湿行瘀清热方治疗口腔扁平苔藓患者前后血清中差异蛋白的定量研究

摘要

第一部分：口腔扁平苔藓动物模型的初步建立
　　目的：采用口腔扁平苔藓患者病变组织匀浆辅以弗氏佐剂针刺划痕法，在NOD/SCID小鼠颊黏膜建立口腔扁平苔藓的动物模型。并尝试在应用人PBL建立具有人免疫学特性的NOD/SCID小鼠模型的基础之上建立口腔扁平苔藓的动物模型。
　　方法：
　　1.OLP-NOD/SCID小鼠模型的建立
　　用少许OLP患者病变组织来制备组织匀浆。选取12只NOD/SCID小鼠，鼠龄4周，雌性，体重20～25 g，动物体形丰满，发育正常，行动迅速，反应灵敏，被毛浓密有光泽，食欲良好。饲养和各项实验操作均在动物实验中心SPF级的层流实验室进行。将其随机分为2组，每组6只。第1组为对照组，采用生理盐水针刺NOD/SCID小鼠颊黏膜4周，隔两天针刺一次。第2组为实验组，采用OLP患者病变组织匀浆辅以弗氏佐剂针刺颊黏膜4周，隔两天针刺一次。处理4周处死，于作用处颊黏膜取材。制成HE染色的病理切片，在光学显微镜下观察病理变化。
　　2.Hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型建立及鉴定
　　2.1.将18只NOD/SCID小鼠随机分为3组，每组6只；第1组，每只腹腔注射人外周血淋巴细胞2×107/0.5ml，作为人免疫重建低剂量组；第2组，每只腹腔注射人外周血淋巴细胞4×107/0.5ml，作为人免疫重建高剂量组；第3组，每只腹腔注射0.5ml生理盐水，作为空白对照组。
　　2.2.从生物学特性和免疫学特性两个方面对小鼠模型进行鉴定：每天观察小鼠的生物学体征；第8周摘眼球取血，利用流式细胞仪检测小鼠外周血中人CD3+、CD4+T淋巴细胞。
　　结果:
　　1.OLP-NOD/SCID小鼠模型的建立
　　肉眼观察实验组针刺划痕组织匀浆后，针刺部位黏膜充血，质地脆弱。镜下观察实验组病理结果：黏膜上皮不全角化，棘细胞层增生，基底细胞可见轻度空泡变性，上皮钉突不规则延长，固有层散在淋巴细胞浸润，但固有层还未出现大量淋巴细胞浸润带的OLP典型病理表现。肉眼观察对照组黏膜无明显变化，镜下观察病理结果：黏膜上皮过度角化，固有层未见炎细胞浸润。
　　2.Hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型建立及鉴定
　　第1组小鼠到第8周营养状态、精神状态良好；通过流式细胞仪检测小鼠外周血中人CD3+、CD4+T淋巴细胞双阳性表达率为3.03±0.47％，表达量不足，未能建立起Hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型。第2组到第8周后发生GVHR反应，并且死亡1只；通过流式细胞仪检测小鼠外周血中人CD3+、CD4+T淋巴细胞双阳性表达率为36.13±4.79%。虽然淋巴细胞已达到一定数量，但小鼠出现了GVHR。第3组小鼠体健，营养状态、精神状态良好，通过流式细胞仪未检测到小鼠外周血中有人CD3+、CD4+T淋巴细胞表达。
　　第二部分：化湿行瘀清热方治疗口腔扁平苔藓患者前后血清中差异蛋白的定量研究
　　目的：本课题小组前期应用双向荧光差异凝胶电泳及质谱技术成功鉴定出化湿行瘀清热方治疗口腔扁平苔藓患者前、后的血清差异蛋白，发现人抗凝血酶Ⅲ、维生素D结合蛋白等在治疗OLP前后的血清中存在差异表达，并通过Western-blot给予了初步的半定量验证。为进一步探讨化湿行瘀清热方对口腔扁平苔藓的影响作用，本研究拟采用ELISA技术在蛋白水平上行进一步准确的定量研究，为OLP可能的发病机制及化湿行瘀清热方的临床应用提供理论依据。
　　方法：
　　选取20例OLP患者，采集治疗前和经化湿行瘀清热方治疗8周后的静脉血，静置30min后离心，吸取上层血清。采用ELISA对OLP患者治疗前后血清中差异蛋白的表达情况进行定量研究。
　　结果:
　　ELISA结果显示人抗凝血酶Ⅲ，维生素D结合蛋白在口腔扁平苔藓患者治疗后的血清中浓度较治疗前均下调(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.本实验采用组织匀浆+弗氏佐剂针刺划痕后的病变部位已出现黏膜上皮不全角化，棘细胞层轻度增生，基底细胞轻度液化变性，上皮钉突不规则延长，固有层散在淋巴细胞浸润的病理表现，较前期实验的黏膜上皮出现棘层增生，固有层散在炎细胞浸润的病理改变，更加接近OLP的病理表现。
　　2.本实验注射人PBL2×107/0.5ml后表达量不足，未能成功建立人PBL-NOD/SCID鼠模型，而注入人PBL4×107/0.5ml后则发生GVHR反应。
　　3.维生素D结合蛋白，人抗凝血酶Ⅲ在口腔扁平苔藓患者治疗后血清中的表达均降低，这两种蛋白表达量的差异与化湿行瘀清热方对口腔扁平苔藓的作用机制有一定关系。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分口腔扁平苔藓动物模型的初步建立

前言

材料方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分化湿行瘀清热方治疗口腔扁平苔藓前后血清中差异蛋白的定量研究

前言

材料方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:中药治疗口腔扁平苔藓的进展

致谢

个人简历