骨髓间质干细胞对不同微环境刺激应答差异的比较分析

摘要

肿瘤的发生一直是困扰人类的医学问题之一。长期以来，人们对于肿瘤的起源存在着各种争论。传统观念认为肿瘤细胞来源于已分化细胞的去分化，并经过发展和演进，最终导致肿瘤发生。在启动阶段，分化成熟细胞受到致癌因素的刺激，基因发生突变；被启动的细胞若进一步受到有丝分裂原的刺激，并经过数次细胞增殖，将DNA损伤永久固定在细胞内，进入促进阶段；促进阶段的细胞若进一步发生累加突变，则最终将演变为肿瘤细胞。但是已分化细胞生命周期短，其染色体的突变要固定下来并传给子代细胞的机会不大。随着对干细胞研究的深入，人们发现干细胞在体内长期存在，并能自我复制和分化，正是由于其在体内的长期存在，使得基因突变更容易在这些细胞中积聚，同时通过自我复制使DNA损伤在细胞内固定下来并传给子代细胞，干细胞是肿瘤启动的天然靶细胞。 正常机体内，干细胞的存在与组织损伤修复、细胞更新有关，是长期进化中形成的对人体的保护机制。研究表明，肿瘤细胞与干细胞具有许多相似性，肿瘤细胞很可能起源于不同分化阶段的干细胞，肿瘤内有干细胞类群的存在。正常干细胞发挥功能时能够根据机体的需要和遗传约束力在增殖与分化之间达到完美的平衡，肿瘤细胞则无法在二者之间达成平衡，是脱离正常生长调控系统，不受增殖调控的细胞。种种迹象表明，干细胞正常分化通路的阻断和干扰可能是肿瘤发生的一个重要原因。然而，究竟是何原因使干细胞背离了正确的分化方向?肿瘤中的干细胞是否来源于正常的干细胞?是否存在有独立的“肿瘤干细胞”?若能找出这些问题的答案，对于深入理解肿瘤的发生机制，进而制定有效的肿瘤防治策略无疑具有十分重要的意义。本课题组前期工作利用肝损伤大鼠模型(2-AAF/CC1<,4>模型)的肝组织萃取物营造的微环境，成功地将骨髓间质干细胞诱导分化为肝细胞，并构建了骨髓间质干细胞向肝细胞定向分化的实验体系。被诱导细胞第7天表达幼稚肝细胞标志GST-P和M<,2>-PK，第20天表达成熟肝细胞的标志Albumin。在另一组实验中，我们使用化学诱癌剂3’-甲基-奶油黄(3’-me-DAB)饲喂同一种动物，却诱发出肝癌。由此推测，在2-AAF/CC1<,4>构建的肝损伤大鼠模型中包含有适合干细胞正常分化的微环境，而在化学诱癌模型中则可能含有阻断和干扰干细胞正常分化通路的因子。本研究拟通过两种不同的肝组织萃取物(2-AAF/CC1<,4>肝损伤组织萃取物和3’-me-DAB化学诱癌肝组织萃取物)，分别营造两个不同的细胞生长微环境，以观察骨髓间质干细胞在不同微环境下的各种生物学变化特征，试图揭示肿瘤发生与干细胞之间的内在联系。 实验方法： 1.骨髓间质干细胞的获取从SD雄性大鼠的双侧股骨和胫骨中用DMEM/F-12冲洗骨髓细胞，采用贴壁法分离出骨髓间质细胞。采用换半液和一传二的传代培养方法，传至第4代。 2.分化刺激物的制备及骨髓间质干细胞的定向诱导分化构建2-AAF/CCL<,4>急性肝损伤动物模型，获取动物肝脏，提取肝组织萃取物。用此萃取物诱导第4代骨髓间质干细胞，并分别收集7天、20天细胞。 3.分化干扰刺激物的制备及骨髓间质干细胞分化的干扰实验构建化学诱癌动物模型，选取第17周和第14周动物，获取动物肝脏，提取肝组织萃取物。用此萃取物刺激第4代骨髓间质干细胞，并分别收集7天、20天细胞。 4.骨髓间质干细胞在不同微环境下生物学变化特征的观察分析通过细胞形态学、细胞周期、核型分析及分子表达谱诸方面的比较观察，分析不同微环境对干细胞正常分化途径的影响。 实验结果： 1.在细胞形态上，分化组细胞在诱导第6天可见成纤维样细胞细长突起缩短，12天后细胞主要呈簇状缓慢生长，中央区域细胞突起完全消失呈圆形或近圆形上皮样形态，外周细胞大部分细胞呈短梭形，15-18天，上皮样细胞继续增多，至20天时几乎所有的细胞均呈上皮样。分化干扰组细胞在刺激第7天长梭形细胞胞体缩短，变宽，11天后中央区细胞可见少量细胞突起消失呈类圆形，但外周细胞仍保持短梭形，并保持这种形态至第20天。 2.在分子表达谱上，分化组细胞在诱导第7天出现幼稚肝细胞的标志GST-P和M<,2>-PK，在诱导第20天出现成熟肝细胞的标志Albumin，分化干扰组细胞刺激第7天出现幼稚肝细胞的标志GSTP和M<,2>PK，并持续表达至第20天，刺激第20天时未见成熟肝细胞标志Abumin的表达。 3.细胞周期上，分化组细胞G<,0>/G<,1>91.4﹪～91.9﹪，S期5.8﹪～7.4﹪、G<,2>/M1．1﹪～2.3﹪，PI值8.1～8.6；与分化组比较，分化干扰组细胞G<,0>/G<,1>比例降低，S期、G<,2>/M期比例升高，PI值增高，分化干扰组细胞增殖活性高。 4.在染色体核型分析上，分化组细胞染色体从数42，染色体范围37～46，染色体少于40占总计数核型的15﹪，分化干扰组细胞染色体从数36～45，染色体范围增宽，染色体少于40的百分率增加，高出分化组22﹪。 5.在细胞超微结构上，分化组细胞呈单层平铺生长，分化干扰组细胞在刺激第7天时亦呈单层平铺生长，但在刺激第20天时部分细胞呈多层重叠生长，失去接触抑制。 结论： 1.骨髓间质干细胞在分化诱导条件下，细胞形态呈现出由最初的以长梭形细胞为主逐渐演变为以上皮样细胞为主的特征性变化，符合骨髓间质干细胞向肝细胞分化过程中展现的形态学特点。而在分化干扰条件下，细胞则始终保持以长梭形细胞为主的形态特征。由此可以判断，微环境的差异己使骨髓间质干细胞的分化进程受到了影响。 2.在分化诱导条件下，骨髓问质干细胞分别于诱导刺激的第7天表达幼稚肝细胞的分子标志GST-P和M<,2>-PK，于第20天表达成熟肝细胞的分子标志Albumin，实现了向肝细胞的终末分化。在分化干扰实验中，骨髓间质干细胞仅在干扰刺激的第7天表达出幼稚肝细胞的分子标志GST-P和M<,2>-PK，却始终未能表达成熟肝细胞的分子标志Albumin。实验表明，骨髓间质干细胞向肝细胞的分化进程已被阻滞在幼稚肝细胞阶段。 3.在分化干扰条件下，处于S期和G<,2>/M期的细胞比例以及代表细胞增殖活性的PI值均高于分化诱导条件下的细胞，表明不同的微环境条件对细胞的增殖活性有重要影响。 4.在分化干扰条件下，细胞染色体范围19-84和非整倍体百分率46﹪明显高于分化诱导状态下的细胞(染色体范围37-46，非整倍体百分率15﹪)，提示细胞染色体组型的稳定性有所降低。 5.扫描电镜结果显示，干扰刺激第20天的细胞出现多层叠加生长的现象，生长方式与肝癌细胞株HepG2相似。提示，部分细胞的接触抑制能力丧失。 6.经比较分析发现，骨髓间质干细胞在分化干扰条件下，无论在细胞形态学、细胞周期、染色体组型稳定性、细胞超微结构和细胞分化状态诸方面都与分化诱导条件下的细胞存在差异和变化。各种数据表明，这些变化正逐步背离骨髓间质干细胞正常的分化进程，有发生转化的倾向。 7.影响骨髓间质干细胞定向分化进程的干扰刺激物来自化学诱癌肝组织。各种数据表明，癌变组织中可能包含有影响干细胞正常分化途径的相关因子。 8.综上所述，干细胞正常分化途径的干扰和阻滞很可能是肿瘤发生的重要原因之一。

目录

文摘

英文文摘

1绪论

1.1干细胞和成体干细胞

1.2肝内与肝外干细胞

1.3肝损伤与肝脏干细胞的激活

1.4骨髓间质干细胞定向诱导分化实验

1.5干细胞与肿瘤的发生

1.6问题的提出

1.7实验设计

2材料与方法

2.1骨髓间质干细胞(BMSCs)的获取

2.2分化诱导刺激物的制备

2.3分化干扰刺激物的制备

2.4骨髓间质干细胞的定向分化诱导实验

2.5骨髓间质干细胞分化方向的干扰实验

2.6骨髓间质干细胞在不同培养条件下的核型分析比较

2.7骨髓间质干细胞在不同培养条件下超微结构的比较(扫描电镜)

2.8骨髓间质干细胞在不同培养条件下细胞周期的分析比较

2.9骨髓间质干细胞在不同培养条件下细胞分化状态的比较

3结果

3.1骨髓间质干细胞在不同培养条件下细胞形态学特征的比较

3.2骨髓间质干细胞在不同培养条件下分子表达谱的比较

3.3骨髓间质干细胞在不同培养条件下细胞周期变化的比较

3.4骨髓间质干细胞在不同培养条件下染色体核型的比较

3.5骨髓间质干细胞在不同培养条件下扫描电镜超微结构的比较

4讨论

4.1骨髓间质干细胞在不同培养条件下细胞形态学的变化特征

4.2骨髓间质干细胞在不同培养条件下分子表达谱的变化特征

4.3骨髓间质干细胞在不同培养条件下细胞周期的变化特征

4.4骨髓间质干细胞在不同培养条件下细胞核型的变化特征

4.5骨髓间质干细胞在不同培养条件下超微结构的变化特征

4.6骨髓间质干细胞正常分化方向的偏离轨迹

4.7影响骨髓间质干细胞正常分化方向的可能因素

4.8干细胞正常分化通路的阻断和干扰可能是肿瘤发生重要原因

5结论

参考文献

附图（一）

致谢

原创性声明