高蛋氨酸膳食促进ApoE小鼠动脉粥样硬化形成的可能机制

摘要

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种严重威胁着人类健康的慢性疾病。在欧美以及许多亚洲国家，该病已成为首要的死亡原因。在我国，随着经济的发展，人们生活水平的提高和饮食结构的改变,AS等一系列心血管疾病也呈逐年上升趋势，严重威胁着人们的生活质量。AS的病因和发病机制还不很清楚，亟待进一步的深入研究。 蛋氨酸(Methionine，Met)是哺乳动物正常生长和发育的必需氨基酸，但如果摄入过多，不仅会干扰其他氨基酸的利用，而且会导致AS等心血管疾病危险性的增高。大量研究显示高Met促进AS发展是通过升高同型半胱氨酸((haomocysteine，Hcy)水平起作用。Hcy是蛋氨酸在体内代谢过程中生成的中间代谢产物，Hcy的进一步代谢转化过程中蛋氨酸合成酶(methionine synthase，MS)、亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetrahydrofolate reductase，MTHFR)和胱硫醚-β-合成酶(cystathionine beta synthase，CBS)三种酶以及叶酸、VitB12、VitB6三种B族维生素是必需的，如果体内的这些代谢酶存在遗传缺陷或各种原因造成的B族维生素缺乏亦或因进食过多的动物蛋白而导致蛋氨酸摄入过多都会影响到Hcy的进一步代谢，使得血中总Hcy水平高于正常。从1969年Kilmer McCuly首次在患有先天性Met代谢障碍及高Hcy尿症的儿童中发现其外周动脉、冠状动脉及脑动脉出现血栓。此后关于Hcy与AS的关系就受到很多关注并成为AS的一个研究热点，Hcy被认为是AS等心血管疾病的独立危险因子。 虽然大多体内体外实验显示Hcy水平的升高与AS发生发展关系密切，但Hcy导致AS发病的机制尚不完全明确。实验研究发现有几个潜在可能机制，包括：内皮功能损伤，低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)的氧化，单核细胞黏附于血管壁，脂质吸收和驻留的升高，炎性途径的激活，平滑肌细胞的增殖，血液凝固因子的激活诱导血栓形成及血小板机能障碍。研究最多的是Hey的内皮损伤作用，Hcy可通过自身氧化产生一系列活性氧中间产物导致内皮依赖性NO生成减少从而导致血管舒张功能障碍，当抑制了由Hcy导致的氧化应激，则可改善内皮功能。另外Hcy可改变组织型纤溶酶原活化物受体、组织型纤溶酶原活化物抑制剂、血栓调节素等内皮源性凝血、抗凝血因子的分泌及活性；以上结果提示Hcy促进氧化应激作用及其后续的炎性反应可能是其致AS的机制之一。 然而，大多的研究仅证明高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia，HHcy)对血管内皮功能的影响，而对AS的影响并未提供充足的证据，大多HHcy动物模型如CBS敲除小鼠，不会自发形成AS斑块损伤。另有一些研究却报道了高Met膳食引起的血管损伤或血管动脉硬化病变与血浆中Hcy的升高无关，补充叶酸、维生素B6和B32虽能使血浆中Hcy维持在正常水平，但不能改善血管损伤，甚至血管损伤比血浆Hey升高的动物更为严重。因此，高Met膳食促进AS的发展的机制尚需进一步研究。 为进一步了解在AS易感模型中高Met膳食致AS是否与Hcy水平有关，本课题以ApoE-I-小鼠为研究对象，通过高Met膳食诱导血浆Hcy水平的升高，以及选用一种已经被理论和实验证实可以降低血浆Hcy水平的物质-DZA促使血浆Hcy水平降低的两种动物模型，进一步探讨高Met膳食促进AS是否与Hey水平有关，即Hcy水平的升降是否会引起AS斑块相应的增减，同时是否伴有ICAM-1、VCAM-1表达及氧化应激状态的改变，从而探讨高蛋氨酸膳食促进AS发生的可能机制。 研究目的： 以ApoE-I-小鼠为研究对象，通过喂饲高Met膳食诱导小鼠AS的形成，研究其代谢产物Hcy水平对AS斑块及小鼠血管损伤情况的影响，探讨高Met膳食促进AS发生的可能机制。 研究方法： 1.实验动物及分组本次实验以36只8周龄ApoE-I-小鼠为研究对象，雌雄各半，按体重随机分成3组进行实验，每组12只，分别接受不同的膳食干预： ①对照组(Control)，喂饲正常饲料； ②高蛋氨酸组(M)，喂饲含1％蛋氨酸饲料； ③高蛋氨酸+DZA组(M+D)，喂饲含1％蛋氨酸同时添加40mg/kg DZA的饲料。实验期间小鼠自由饮水摄食，保证12小时白天，12小时黑夜的环境，每周称量体重一次，记录各组动物的摄食量，共计喂养8周，实验期满做如下处理： (1)眼眶静脉取血分离EDTA．Na2抗凝血浆，分装保存于-20℃。 (2)颈椎脱臼处死全部小鼠，并取出心脏、肝脏、脾脏、肾脏用于脏器系数评价。 (3)取小鼠新鲜心脏，冷生理盐水冲洗干净，用滤纸吸干多余液体，10％中性福尔马林中浸泡过夜后做主动脉窦冰冻切片用于动脉粥样斑块面积分析。 (4)分离小鼠主动脉，将其分为两段，自胸主动脉起始端小心剪下3-4mm动脉环放入10％中性福尔马林缓冲液中固定过夜，用于制作冰冻切片，进行免疫组化测定；其余-80℃冻存用于匀浆液制备进行SOD活性检测。 2.检测指标及方法 2.1血浆总同型半胱氨酸浓度的测定-荧光偏振免疫分析法(nuorescence polarization immunoassay,FPIA)。 2.2小鼠主动脉窦冰冻切片的斑块面积：油红O染色法。 2.3小鼠主动脉中ICAM-1、VCAM-1表达测定：免疫组化法。 2.4小鼠主动脉超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测：黄嘌呤氧化酶法2.5小鼠血浆丙二醛(malonyldialdehyde，MDA)含量测定：硫代巴比妥酸法。 实验结果： 1.不同实验组小鼠的一般情况在喂养的8周期间，三组小鼠的日平均进食量以高蛋氨酸组为最低，但各组间均无显著性差异，三组的平均进食量约为2.76g/d：三组实验小鼠的体重都有增长的趋势，随着喂养时间的变化，不同实验组小鼠之间体重无显著性差异；且各组间心脏、肝脏、脾脏和肾脏重量无显著性差异，各组间脏器与体重的比值均无显著性差异。 2.不同Hcy水平对小鼠主动脉窦的AS斑块的影响高蛋氨酸组(M)小鼠血浆Hcy水平为16.42+1.96μmol/L，较对照组(Control)显著升高，是Control组(4.60±0.90)的3.57倍，升高了257.0％，且该组小鼠主动脉窦AS斑块面积(25.81±3.10％)也明显增高，为Control组(18.70±3.70％)的1.38倍，较Control组升高了38.0％：而高蛋氨酸+DZA组(M+D)小鼠血浆Hcy水平为8.99+1.47μmol/L，较M组显著下降了45.2％，AS斑块面积(9.52±2.17％)较M也明显降低了63.1％。对Hcy水平与AS斑块进行相关性分析发现它们之间的相关系数为0.528(P<0.05)，即Hcy水平与AS斑块面积呈正相关关系。 3.不同实验组小鼠主动脉ICAM-1、VCAM-1蛋白相对表达量显微镜低倍镜下观察，可见M组小鼠主动脉ICAM-1、VCAM-1蛋白相对表达量较Control组显著增高，而M+D组动脉中的ICAM-1、VCAM-1蛋白相对表达量较M组显著下降，且低于Control组。将小鼠血浆Hcy水平与ICAM-1、VCAM-1的蛋白相对表达进行相关性分析发现，血浆Hcy水平与ICAM-1表达水平呈正相关(r=0.782，P<0.01)，与VCAM-1表达水平呈正相关(r=0.630，P<0.01)，即小鼠血浆中Hcy水平越高，则其动脉的ICAM-1和VCAM-1表达水平越高。 4.不同实验组小鼠主动脉SOD活性本实验各组小鼠主动脉的SOD的活性，M组小鼠主动脉的SOD活性为38.74+8.33 U/mg protein，较Control组的60.27+6.84 U/mg protein下降了36％，而M+D组SOD活性(89.87+6.39U/mg protein)较M组明显增高，增高幅度为132％。将小鼠血浆Hcy水平与主动脉SOD活性进行相关性分析发现，血浆Hcy水平与主动脉SOD活性呈负相关(r=-0.544，P<0.01)，即Hcy水平越高，则动脉SOD活性越小。 5.不同实验组小鼠血浆MDA浓度M组血浆MDA浓度为37.89±7.45 nmol/ml，明显高于其他组，是Control 组(18.94±2.74 nmol/ml)的2倍，而M+D组MDA浓度为8.46±3.19nmol/ml，较M组下降了77.7％。将小鼠血浆Hcy水平与血浆MDA浓度进行相关性分析发现，血浆Hcy水平与血浆MDA浓度呈正相关(r=0.743，P<0.01)，即血浆中Hey含量越高，则血浆MDA相应也越高。 结论： 高蛋氨酸膳食促进AS发生，与Hcy水平的升高有关，其机制可能是通过Hcy引起体内氧化损伤，从而刺激小鼠主动脉ICAM-1、VCAM-1的高表达，引起炎性反应，最终导致AS的发生。

目录

文摘

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第1章 前言

第2章 材料与方法

第3章 结果

第4章 讨论

第5章 结论

参考文献

致谢