香蕉(Musa spp.)不对称体细胞融合再生植株的鉴定

摘要

香蕉(Musa spp.)是最重要的热带、亚热带水果之一，具有很高的经济价值。然而现在的香蕉病害逐年严重，因此如何培育高产高抗的优质新品种，已经成为香蕉产业面临的最为迫切的问题。由于香蕉主要栽培品种的不育性，难以采用传统的育种方法进行遗传改良，利用生物技术方法，如基因工程、体细胞突变和原生质体融合等，可望实现改良香蕉种质的目的。其中，原生质体融合技术能克服有性杂交遇到的远源杂交不亲和性障碍，还能实现多基因控制性状或未知基因性状的转移，并具有生物安全性。 本研究利用RAPD(randomly amplified polymorphism DNA)，CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)等分子标记技术，POD(peroxidase)同工酶分析，流式细胞术(flow cytometry，FCM)以及基因组原位杂交技术(genomic in situ hybridization，GISH)，分别对本实验室通过原生质体不对称融合技术获得的17棵龙牙蕉(Musa AAB silk cv．Guoshanxiang)与大蕉(Musa ABB paradisiaca Linn．cv．Dajiao)待检测的不对称体细胞融合再生植株以及3棵龙牙蕉与贡蕉(Musa AA acuminata cv．Mas)不对称体细胞融合再生植株(肖望，2007)进行鉴定，以期从分子水平，生物化学水平，细胞学水平等多方面揭示融合再生后代的生理生化及遗传特征。 RAPD分子标记技术以其快速、操作简单、价格低廉等优点，成为杂种鉴定最常用的方法。在所用的40个RAPD引物中，有12个引物可以清楚地扩增出龙牙蕉和贡蕉两个亲本之间的差异带，16个引物可以清楚地扩增出龙牙蕉和大蕉两个亲本之间的差异带。利用筛选出来的这些引物对不对称融合再生植株进行RAPD检测。在以贡蕉为供体，龙牙蕉为受体的3株不对称融合再生植株中，引物OPA17和OPD11在L×G2号融合再生植株中检测到供体贡蕉的特征条带，因此可以鉴定其为杂种。通过引物OPS01和OPH09的鉴定，在以大蕉为供体，龙牙蕉为受体的17个不对称融合再生植株中，其中9株(即L×D17，L×D20，L×D21，L×D23，L×D26，L×D28，L×D29，L×D30，L×D34)的RAPD图谱显示它们都含有受体亲本龙牙蕉与供体亲本大蕉的条带，因此被鉴定为杂种。实验结果显示，在供试的20株体细胞不对称融合再生植株中，RAPD条带图谱大部分表现为受体亲本的条带(5-9条)，只有少数(1条)供体亲本的条带进入融合后代中，显示出高度不对称性。 不对称体细胞杂种可分为核不对称杂种和胞质杂种两类。为了了解供试材料是否存在胞质杂种，利用酶切片段多态性DNA(CAPS)技术对融合再生植株进行检测。结果表明，在所供试的20株融合再生植株中没有筛选到胞质杂种，融合再生植株的CAPS图谱与受体亲本一致，无供体亲本的条带，也没有出现重组条带。此外，在所使用的引物/限制性内切酶的组合中，龙牙蕉和贡蕉的线粒体DNA的差异比较小，只有1个引物/限制性内切酶组合可以区分龙牙蕉和贡蕉的线粒体DNA。而有10个引物/限制性内切酶组合可以区分龙牙蕉和大蕉的线粒体基因组DNA。我们推测，龙牙蕉与贡蕉的线粒体在进化上趋于一致，CAPS有可能成为研究香蕉分类的一种新的分子标记。 同工酶作为一种生物化学标记，在杂种的鉴定中被广泛应用。其中过氧化物同工酶与植物抗病性息息相关。通过亲本及融合后代的过氧化物同工酶检测发现，所有融合再生植株的POD同工酶谱带都与受体亲本龙牙蕉一致，不存在供体亲本贡蕉或大蕉的特征条带。这说明融合再生植株的过氧化物同工酶只表现受体亲本的特征。 利用流式细胞术对融合再生植株进行倍性鉴定，可以做为杂种鉴定的证据。以二倍体野生蕉为内参，利用流式细胞术对龙牙蕉与大蕉的融合再生植株及亲本进行倍性鉴定，实验发现，受体亲本龙牙蕉为三倍体，融合再生植株的倍性与亲本一致，都为三倍体。通过不对称融合得到的再生植株不存在异倍体或多倍体，证明所获得的融合再生植株为高度不对称体细胞杂种。 基因组原位杂交技术(GISH)能揭示外源DNA在细胞内的整合状况，为杂种鉴定提供直接证据。以供体大蕉基因组DNA为探针，受体龙牙蕉基因组DNA为封阻，对部分龙牙蕉与大蕉不对称融合再生植株进行GISH鉴定。实验结果显示，L×D6，L×D23，L×D29三棵融合再生植株染色体中具有8-10条大蕉DNA的异位片段，鉴定为体细胞杂种。融合再生植株中不存在完整的大蕉染色体，表明获得了高度不对称的杂种植株。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1原生质体融合研究进展

1.2体细胞融合体系的类型

1.3体细胞杂种的鉴定

1.4原生质体融合技术在香蕉上的应用

1.5本研究的目的与意义

第二章实验材料及方法

2.1材料和仪器

2.2香蕉叶片DNA的提取

2.3体细胞不对称融合再生植株核基因组的RAPD分析

2.4胞质杂种鉴定--CAPS分析

2.5体细胞不对称融合再生植株核基因组的AFLP分析

2.6氧化物酶同工酶(POD isozyme)电泳检测融合再生植株

2.7流式细胞术检测融合再生植株

2.8不对称融合再生植株的GISH分析

第三章结果与分析

3.1香蕉叶片DNA的提取效果

3.2不对称体细胞融合再生植株的核基因组分析--RAPD

3.3运用CAPS分子标记对不对称融合再生植株胞质基因组的检测

3.4运用AFLP分子标记对不对称融合再生植株核基因组的检测

3.5过氧化物酶同工酶(POD Isozyme)电泳检测融合再生植株结果

3.6流式细胞术(FCM)对融合再生植株的检测

3.7不对称融合再生植株的GISH分析结果

第四章讨论

4.1香蕉叶片DNA提取的影响因素

4.2 RAPD分子标记对融合再生植株核基因组的鉴定

4.3运用CAPS技术对融合再生植株胞质基因组的鉴定

4.4 AFLP对融合再生植株核基因组的鉴定

4.5过氧化物同工酶电泳对融合再生殖的鉴定

4.6流式细胞术(FCM)对融合再生植株的鉴定

4.7基因组原位杂交技术(GISH)对融合再生植株的鉴定

总结

1 结论

2有待进一步研究的内容

参考文献

附录

致谢