乙肝病毒相关性肝硬化及原发性肝癌血清证候蛋白质组初步研究

摘要

肝硬化(Hepatic cirrhosis，HC)是许多慢性肝脏疾病的晚期阶段，是肝脏慢性、弥漫性、进行性的病变。引起肝硬化的病因很多，在我国以乙型肝炎病毒感染最为常见。原发性肝癌(primary hepatic carcinOma，PHC)是常见肿瘤之一，其中90％为肝细胞癌(hepatic celluar cancer，HCC)，其致病原因尚未完全明确，肝炎病毒的感染被认为是原发性肝癌的主要病因，我国大陆地区主要为乙型肝炎病毒感染。慢性病毒性肝炎、肝炎后肝硬化及原发性肝癌三者之间存在着密切联系，从一定意义上已被认为是一个疾病的不同发展阶段。对于HC和HCC辨证论治的临床与实验研究是中医肝病领域中的热点，已有的研究从分子生物、免疫、组织病理、影像学等多角度、多层次入手，初步证实了各证型与相关指标之间的联系。目前为止，还没有较为全面和公认的反映“证”本质的指标出现，仍需要做进一步的研究。 中医的“证”是生命物质在疾病过程中具有时相性的本质的反映，“候”是病变的临床表现。由于中医学对于疾病的认识侧重于整体、宏观、司外揣内，重视疾病某阶段机体的整体状态，辨证论治也即是通过对疾病表现在外的征象，进而推测演绎疾病的病因、病性、病位，由此归纳出证的概念。证候蛋白质组学是指在证候理论指导下，运用功能蛋白质组学的方法，通过探讨证候，特别是同病异证或异病同证的蛋白质差异表达及翻译后的修饰情况，揭示与某一证候形成相关的所有蛋白质及其特征，在整体蛋白质表达的水平上阐明证候的本质。蛋白质是生命活动中多项功能的执行体，实际上每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体在不同时间和空间出现，并发挥功能的不同组合的结果。从组成人体的物质分子方面分析引起“证”的物质基础时，中医“证”的本质是一类具有信使分子性能的蛋白质和肽类分子。蛋白质组研究从整体水平上反应了疾病过程中蛋白质表达的动态演变过程，这与中医辨证论治的认识方法具有极大的相似性。研究目的本研究辨病与辨证相结合，从临床密切相关的两种疾病入手，运用蛋白质组技术，分别研究和求证每种疾病特异性蛋白以及二者在相应证候相关性的蛋白质基础。通过对正常和病变样本、异病同证、同病异证之间的蛋白质组成分差异的比较，从整体上发现某些疾病或证候的特有蛋白质的表达，在复杂的多种致病因素作用下寻找证候的共同本质，探讨蛋白质多态性与疾病中医分型、辨证用药之间的系统的有规律的联系。 研究方法 本课题以乙肝相关性肝硬化和原发性肝癌患者为研究对象，在中医理论的指导下，筛选出两种疾病中肝气郁结和肝肾阴虚型病例。运用蛋白质组学研究中常用的二维凝胶电泳(2-DE)分离方法，结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术，分析正常和病变样本、异病同证、同病异证之间的差异蛋白质组成分。 1、原发性肝癌中医辨证分型标准的临床研究本次辨证标准的研究通过文献调研制定症候调查表、临床辨证资料的收集、因子分析以及临床再检验等四各步骤，初步完成了在一定范围内部分人群HCC辨证分型标准的制定，所制定的辨证标准在临床运用中也取得了较为满意的效果。 2、血清蛋白质组的2-DE分离由于血清蛋白质成分复杂，各组分间浓度差异大等特点，对血清蛋白质组2-DE分离中的各项技术条件加以优化处理。采用丙酮沉淀与“盐桥”相结合的方法除盐，促进2-DE分离中的有效聚焦；以更长的窄范围胶条提高上样量，增强低丰度蛋白的分离效果；以高伏小时数改善电泳时一向的聚焦效果。通过上述的各项技术改良，完善和提高了原有的技术平台，建立了更为稳定的2-DE分离技术系统。实验中尝试使用试剂盒去除血清中高丰度的白蛋白和IgG，但经试剂盒处理过的血清2-DE分离后蛋白斑点明显减少，蛋白丢失较多，故在实验中未选用该方法。 3、凝胶染色和图像分析对2-DE分离所获得的凝胶采用新型胶体考染技术，在提高凝胶染色灵敏度的同时，减少对后期质谱检验的干扰。染色和脱色后的PAGE胶以透射扫描仪扫描成像。运用PDQuest-7.1.0软件分析凝胶图像，获取每一个蛋白斑点的表达量、等电点等信息，设定表达量差异2倍以上的为差异表达蛋白，分析结果由软件自动生成，人工加以验证。 4、差异蛋白质斑点质谱鉴定和数据库确认差异蛋白质斑点进行肽指纹(peptide mass fingerprint，PMF)检测香港大学基因研究中心检测鉴定。根据NCBInr和SWISS-PROT数据库检索分析，寻找与目的PMF相匹配的蛋白质，并检索该蛋白的相关信息。 研究结果 l、通过对临床流调所得资料的因子分析，提取了4个与临床证型契合度较高的公因子。根据统计学分析结果，结合临床验证，将HCC分为肝郁气滞、湿热内蕴、肝肾阴虚、脾肾阳虚、肝血瘀阻5个证型，并制定出相应的辨证标准。 2、获得了较为满意的血清蛋白质组2-DE凝胶电泳图像。改良后的血清2-DE分离技术，即使在不去除高丰度蛋白的条件下也能达到较理想的蛋白分离效果，避免了去除高丰度蛋白所带来的蛋白丢失。 3、经2-DE分离、凝胶图像的软件分析，筛选出具有明显表达差异的蛋白质斑点35个，分布在不同的比较组中。 4、经过对差异蛋白斑点的PMF分析和数据库检测，鉴定出9种差异蛋白质，分别是：载脂蛋A-1、转甲状腺素蛋白、α<,1>-抗胰蛋白酶、维生素D结合蛋白、触珠蛋白、血清类粘蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原、血清白蛋白前体。 结论 本研究首次运用证候蛋白质组学的方法，在乙肝后肝硬化和原发性肝癌患者中寻找同病异证和异病同证的蛋白质组基础。通过临床研究制定原发性肝癌的辨证标准，采用2-DE联合质谱鉴定技术，对乙肝后肝硬化和原发性肝癌以及其中肝气郁结型和肝。肾阴虚型患者的血清蛋白质组进行分析，分离并鉴定出相关差异表达的蛋白质。这些蛋白涉及机体代谢、免疫、凝血、内分泌以及肿瘤细胞增殖代谢等多个领域。通过本次研究发现认为：一、“异病同证”的诊断确实存在蛋白质基础；二、对证本质的研究要坚持“病”与“证”相结合的原则，重视病对证的影响；三、“同病异证”的比较研究是“证”的特异性客观指标筛选的不可或缺的环节。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第1章理论研究

1.1肝硬化、肝癌相关中医文献记载

1.2乙肝后肝硬化、肝癌中医辨证的规范化研究进展

1.3蛋白质组学在证候研究中的可行性分析

第2章原发性肝癌辨证规范化临床研究

2.1研究方法

2.2研究结果

第3章实验研究

3.1乙肝后肝硬化和原发性肝癌血清证候蛋白质组实验研究

3.1.1研究对象

3.1.2材料与方法

3.1.3实验结果

3.1.4讨 论

3.2差异蛋白质的质谱鉴定和数据库确认

3.2.1质谱前样品处理

3.2.2质谱分析

3.2.3数据库搜索

3.2.4检测结果

第4章讨论

4.1差异蛋白质功能分析

4.2鉴定的差异蛋白对于本项研究的意义

4.3中医证候学的研究体会

全文总结

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢