小G蛋白RhoA在伊马替尼耐药中的作用及其调控的初步研究

摘要

研究背景和目的： 伊马替尼(imatinib，又名STI571，商品名格列卫)是首个用于肿瘤临床治疗的分子靶向药物，它因能特异性作用于一组蛋白酪氨酸激酶(包括ABL、Arg、Kit和PDGFR等)，而对多种肿瘤治疗具有潜在的应用价值。在临床上，伊马替尼主要用于慢性髓系白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)，其作用机制是竞争性地与P210BCR-ABL蛋白上的ATP结合位点结合，有效抑制P210BCR-ABL蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)活性而诱导肿瘤细胞凋亡。2001年，伊马替尼正式用于CML治疗，取得了显著的临床疗效，成为目前CML慢性期的首选治疗。但值得注意的是，伊马替尼治疗对于CML急变期疗效并不明显，不少患者存在原发耐药；而部分慢性期患者也在治疗过程中出现继发耐药现象，其中多数很快进入急变期。因此，如何克服耐药，延长患者的生存期也就成为了当前CML治疗中急待解决的突出问题。 有研究表明，P210BCR-ABL蛋白可通过自身Db1同源区与RhoA等小分子G蛋白结合，并激活其下游通路，参与CML发病过程。而Ohmine研究发现，伊马替尼诱导耐药的CML急变细胞系(命名为KCL22/SR)，其P210BCR-ABL蛋白表达及磷酸化程度并无增高，也不存在ab1激酶区点突变，进一步采用DNA表达谱芯片分析发现小分子G蛋白Rho家族重要成员RhoA高表达。我们前期研究中，应用基因表达谱芯片技术对伊马替尼诱导凋亡和诱导耐药前后K562细胞(CML急变细胞系)基因表达差异分析发现，RhoA在伊马替尼诱导凋亡的K562细胞中(1.0uM伊马替尼处理24小时)中呈低表达(ratio值0.321)，而在伊马替尼耐药的K562细胞中呈高表达(ratio值2.587)。这些研究结果提示RhoA可能在伊马替尼耐药中扮演了重要角色。 目前，RhoA在伊马替尼耐药中的具体作用仍不清楚。因此，本课题中，我们从临床伊马替尼耐药CML患者和伊马替尼耐药细胞系两个研究对象，检测耐药前后RhoA表达变化，分析其调控机制；进一步应用RNA干扰技术研究RhoA基因表达下调对耐药细胞生物学行为的影响，为多靶点联合治疗伊马替尼耐药提供新的实验基础和理论依据。 研究方法： 1.临床耐药标本的收集与耐药细胞模型的建立 收集伊马替尼耐药前后CML患者骨髓白血病细胞，提取细胞总RNA和蛋白，-80℃保存备用。前期研究中我们以野生型K562细胞(简写为K562-W)为对象，采用剂量递增法，诱导出伊马替尼耐药浓度为0.5uM，耐药倍数为(2.04±0.16)倍的低度耐药K562细胞。本实验中，我们继续用该法进行了耐药细胞(简写为K562-R)的诱导，并用MTT法，流式细胞术和基因测序等技术对其进行生物学特性分析。 2.RhoA在伊马替尼耐药细胞中的表达分析 采用半定量PT-PCR和Westernblotting技术检测伊马替尼耐药前后RhoA的mRNA和蛋白表达情况。 3.伊马替尼耐药中RhoA表达调控通路分析 CML相关信号转导通路特异性抑制剂包括PD98059(Ras/MAPK信号通路特异性抑制剂)、LY294002(PI3K/AKT信号通路特异性抑制剂)、AG490(JAK/STAT信号通路特异性抑制剂)分别处理K562-W和K562-R细胞2、4、8小时，采用Westernblotting技术观察RhoA的蛋白表达变化。 4.特异性siRNA转染K562-R细胞 按照siRNA设计原则，设计、合成4对siRNA-RhoA(分别命名为siRNA-RhoA54，siRNA-RhoA153，siRNA-RhoA220，siRNA-RhoA256)，设阳性对照组(siRNA-GAPDH)和阴性对照组(siRNA-NC)。 流式细胞术分析不同终浓度(100nM、150nM和200nM)FAM荧光标记siRNA-NC转染K562-R细胞转染效率；Western-Blotting检测siRNA-GAPDH转染24、48、72小时后对GAPDH表达抑制情况，并检测4对siRNA-RhoA转染对K562-R细胞RhoA蛋白表达抑制情况。确定脂质体法转染K562-R细胞的最佳转染条件。 5.RhoA低表达对K562-R细胞生物学特性影响 PI染色后流式细胞术分析细胞周期变化；AnnexinV-PI双标法和Hoechst33258染色检测细胞凋亡率；流式细胞术检测CD71和GPA分析细胞红系分化情况，并检测CD29(整合素β1)分析细胞表面粘附分子表达差异。 研究结果： 1.RhoA在伊马替尼耐药CML患者中的表达情况 共收集8名CML患者骨髓标本，伊马替尼治疗有效5名(其中包括4名慢性期和1名急变期患者)，伊马替尼耐药患者3名(均为急变期患者)。RhoA的mRNA和蛋白在所有患者中均有表达；与非耐药患者相比，伊马替尼耐药患者在mRNA和蛋白表达增多有显著性意义(P值分别为0.031和0.014；SPSS10.0软件，两个独立样本的t检验)。 2.耐药细胞诱导及其生物学特性分析 伊马替尼浓度递增法诱导低度耐药的K562细胞，经3个月建立了耐药浓度为1.0uM的K562-R细胞系。MTT法检测K562-W和K562-R的半数抑制浓度(50％inhibitingconcentration，IC50)分别为(2.11±0.07)uM和(31.97±2.51)uM，K562-R耐药倍数是(15.16±0.70)倍；两组抑制率比较有显著性意义(P<0.001；SPSS10.0软件，配对样本t检验)。基因测序未发现K562-R细胞BCR-ABL基因激酶区点突变。流式细胞术分析K562-R细胞BCR-ABL激酶底物分子CRKL磷酸化程度增高(P<0.001；SPSS10.0软件，四格表资料的x2检验)，间接提示耐药细胞BCR-ABL激酶活性增强。信号传导分子RhoA蛋白在耐药细胞表达增多有显著性意义(P=0.003；SPSS10.0软件，两个独立样本t检验)。 3.伊马替尼耐药中RhoA表达调控通路分析 PD98059(RAS-MAPK通路抑制剂)对两种细胞RhoA蛋白表达均有抑制作用，随着处理时间的延长，K562-R细胞RhoA蛋白表达很快恢复，而K562-W没有明显恢复。LY294002(PI3K通路抑制剂)对K562-R和K562-W细胞RhoA蛋白均无明显影响。AG490(JAK/STAT通路抑制剂)处理2小时，对两种细胞RhoA蛋白表达都有明显抑制作用，但均很快恢复。 4.siRNA-RhoA脂质体法(lipofectamine2000)转染K562-R细胞模型建立 FAM标记的siRNA-NC脂质体法转染K562-R细胞，150nM浓度时转染效率最高(75.28％)：siRNA-GAPDH转染K562-R细胞48小时对GAPDH表达抑制最明显；4对siRNA-RhoA转染K562-R细胞，其中siRNA-RhoA-256对RhoA蛋白抑制率高于其它3对。故选取150nM浓度的siRNA-RhoA256转染48小时的K562-R细胞做为下一步实验的细胞模型。 5.RhoA低表达对K562-R细胞生物学特性影响 siRNA-RhoA-256转染48小时后，K562细胞出现凋亡，AnnexinV-PI双标FACS和Hoechst33258荧光染色分析细胞凋亡率分别为12.82％和9.0％，与阴性对照(分别为5.63％和3.5％)相比，具有显著统计学意义。细胞周期分析发现，G0/G1细胞增高(51.94％，P值小于0.001；SPSS10.0软件，四格表资料的x2检验)。K562-R红系分化指标CD71为49.89％，GPA表达率88.58％，与阴性对照相比变化不大，而细胞粘附分子CD29表达增多有显著性意义(P值小于0.001；SPSS10.0软件，四格表资料的x2检验)。 初步结论： RhoA与CML伊马替尼耐药的关系及其潜在功能与调控机制目前未见相关报道，我们研究发现： 1.RhoA在伊马替尼耐药与非耐药CML患者中均表达，前者在mRNA和蛋白水平表达均高于后者，提示RhoA的高表达与伊马替尼耐药密切相关，可能是临床诊治耐药一个新的潜在靶点。 2.通过用多种CML相关信号通路抑制剂处理K562-R细胞，发现Ras-MAPK信号通路抑制剂PD98059和JAK/STAT通路抑制剂AG490对K562-R细胞RhoA蛋白表达均有明显抑制作用，表明在P210BCR-ABL依赖的伊马替尼耐药细胞中，RhoA表达受多条CML相关信号通路的调节，可能是耐药信号通路下游的一个关键点。 3.siRNA-RhoA256脂质体法转染K562-R细胞48小时，RhoA蛋白表达有明显抑制。与阴性对照组比较，细胞周期出现G0/G1期阻滞，细胞凋亡率增高，粘附分子CD29表达增多，提示RhoA高表达在伊马替尼耐药中的潜在作用可能涉及增加细胞增殖活力、提高细胞抗凋亡能力和改变细胞粘附性状等方面。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词表

声明

第一章前言

第二章RhoA在伊马替尼耐药CML患者中的表达

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第三章RhoA在伊马替尼耐药细胞系的表达及其调控分析

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第四章特异性siRNA抑制RhoA表达对K562-R细胞生物学特性的影响

一、材料

二、方法

三、结果

4．讨论

全文小结

参考文献：

综述：慢性粒细胞白血病急变期分子遗传学研究进展

致谢

博士期间取得的成果