CD8+CD28-T淋巴细胞介导缺血预处理保护大鼠肾脏早期热缺血再灌注损伤的作用研究

摘要

目的：
　　 1.建立双后肢远距离缺血预处理(remote ischemic preconditioning，RIP)保护大鼠肾脏早期热缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)的实验模型。
　　 2.探讨T淋巴细胞介导大鼠肾脏早期热IRI的作用机制。
　　 3.探讨肾脏缺血预处理(kidney ischemic preconditioning，KIP)、RIP保护大鼠肾脏早期热IRI的免疫机制。
　　 4.探讨免疫调节细胞--CD8+CD28-T淋巴细胞及相关免疫因素在KIP、RIP保护大鼠肾脏早期热IRI中的作用。
　　 方法：
　　 1.建立大鼠肾脏早期热IRI实验模型。
　　 SPF级(清洁级)雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠40只，随机分为四组，每组10只，各组大鼠切除右肾后，分别使用无损伤血管钳阻断左侧肾蒂0min、30min、45min和60min后开放灌注2h。各组均于灌注2h后获取下腔静脉血和肾脏组织标本。检测血清肌酐(Scr)，肾脏标本脏染色后光镜下观察组织结构变化，同时采用Paller法评分了解肾小管损害程度。根据各组肾功能检测和大鼠存活情况确定符合本研究要求的肾蒂阻断时间，即保持大鼠再灌注2h后生存率>90％，同时肾脏功能和结构严重损伤。
　　 2.建立KIP保护大鼠肾脏早期热IRI实验模型。
　　 SPF级雄性SD大鼠60只，随机分为六组，每组10只：假手术对照组(Sham)、IRI组、KIP1+IRI组(左肾蒂阻断血流8min，松开5min，1次+IRI)、KIP2+IRI组(左肾蒂阻断血流8min，松开5min，重复2次+IRI)、KIP3+IRI组(左肾蒂阻断血流8min，松开5min，重复3次+IRI)、KIP4+IRI组(左肾蒂阻断血流8min，松开5min，重复4次+IRI)。Sham组切除右肾、游离左肾蒂后不予其它处理观察；IRI组切除右肾后以实验1中确定的时间为左肾蒂阻断缺血时间，之后开放灌注2h。KIP+-IRI各组行开腹后切除右肾，以无创伤血管夹阻断左肾蒂血流8min，松开5min，1-4次，接着夹闭左肾蒂60min后再灌注2h。消毒、切腹手术至准备进行左肾缺血再灌注实验前的时间统一在30min(除外预处理时间)。各组均于灌注2h后获取下腔静脉血和肾脏组织标本。检测血清肌酐(Scr)，肾脏标本HE染色后光镜下观察结构变化，同时采用Paller法评分了解肾小管损害程度。综合分析各指标结果确定KIP实验模型。
　　 3.建立RIP保护大鼠肾脏早期热IRI实验模型。
　　 SPF级雄性SD大鼠60只，随机分为六组，每组10只：Sham组、IRI组、RIP1+IRI组(股动静脉阻断血流5min，松开5min，1次+IRI)、RIP2+IRI组(股动静脉阻断血流5min，松开5min，重复2次+IRI)、RIP3+IRI组(股动静脉阻断血流5min，松开5min，重复3次+IRI)、RIP4+IRI组(股动静脉阻断血流5min，松开5min，重复4次+IRI)。Sham组切除右肾、游离左肾蒂后不予其它处理观察；IRI组行腹正中切开切除右肾后，以无创伤血管夹夹闭左肾蒂60min.再灌注2h。RIP各组行开腹切除右肾后于双后肢腹股沟区切开寻找到股动静脉给与不同次数的血流阻断，然后以无创伤血管夹夹闭左肾蒂60min，再灌注2h。消毒、切腹手术至准备进行左肾缺血再灌注实验前的时间统一在30min(除外预处理时间)。各组均于灌注2h后获取下腔静脉血和肾脏组织标本。检测血清肌酐(Scr)，肾脏标本HE染色后光镜下观察组织结构变化，同时采用Paller法评分了解肾小管损害程度。综合分析各指标结果确定RIP实验模型。
　　 4.CD8+CD28-T淋巴细胞及相关免疫因素在KIP、RIP保护大鼠肾脏早期热IRI的作用。
　　 SPF级雄性SD大鼠40只，随机分为四组，每组10只。Sham组、IRI组、KIP+IRI组、RIP+IRI组。Sham组切除右肾、游离左肾蒂后不予其它处理观察；IRI组行腹正中切开切除右肾，以无创伤血管夹夹闭左肾蒂60min后再灌注2h；KIP+IRI组行开腹后切除右肾，以无创伤血管夹阻断左肾蒂血流8min，松开5min，重复4次，接着夹闭左肾蒂60min后再灌注2h；RIP组行开腹切除右肾后于双后肢腹股沟区切开寻找到股动静脉给与血流阻断5min，松开5min，重复4次，然后以无创伤血管夹夹闭左肾蒂60min，再灌注2h。消毒、切腹手术至准备进行左肾缺血再灌注实验前的时间统一在30min(除外预处理时间)。各组均于灌注2h后分别获取下腔静脉血和肾脏组织标本。检测血清肌酐(Scr)、IL-10(酶联免疫吸附法ELISA)；流式细胞仪测外周血CD8+CD28-T、CD28+T、CD8+CD28+T、CD8+CD152+T、CD8-CD152+T、CD8+T淋巴细胞比例；检测分析外周血CD8+CD28-T淋巴细胞与其它指标的相关性；肾脏标本分别在光镜和电镜下观察其组织结构变化，同时采用Paller法评分评价肾小管受损程度。
　　 结果
　　 1.肾脏热缺血时间即肾蒂钳夹时间的确定各组大鼠左肾蒂钳夹0min，30min、45min和60min，再灌注2h后，生存率均为100％，30min组、45min组肾小管坏死Pallet法评分与0min组相比存在差异(P<0.05)，但这两组血清Scr与0min组相比无明显差异(P>0.05)，提示肾蒂钳夹时间小于45min肾功能受损尚不严重，未造成明显的肾脏热IRI。60min组大鼠存活率大于90％，血清Scr、肾小管Paller法评分与0min组比较显著升高，均有统计学意义(P<0.05)，提示发生了明显的肾脏热IRI，综合以上，确定本实验大鼠肾脏早期热IRI模型为：左肾蒂钳夹阻断60min后，再灌注2h。
　　 2.KIP对大鼠肾脏早期热IRI的保护效应及模型的建立Sham组血清Scr水平为44.74±5.77μmol/L、肾小管Paller法评分7.00±1.25。IRI组、KIP1+IRI组、KIP2+IRI组、KIP3+IRI组、KIP4+IRI组Scr水平、肾小管Pallet法评分与Sham组比较差异明显，均有统计学意义(P<0.05)；但KIP1+IRI组、KIP2+IRI组、KIP3+IRI与IRI组相应指标比较差异不明显，无统计学意义(P>0.05)；KIP4+IRI组血清Scr水平、肾小管Pallet法评分与IRI组相比明显好转，有统计学差异(P<0.05)。综合以上，确定本实验KIP保护大鼠肾脏早期热IRI的模型为：左肾蒂阻断血流8min，松开5min，重复4次，随即左肾蒂钳夹60min后再灌注2h。
　　 3.RIP对大鼠肾脏早期热IRI的保护效应及模型的建立Sham组血清Scr水平为44.52±3.91μmol/L、肾小管Paller法评分7.50±1.58。IRI组、RIP1+IRI组、RIP2+IRI组、RIP3+IRI组、RIP4+IRI组血清Scr水平、肾小管Pallet法评分与Sham组比较差异明显，均有统计学意义(P<0.05)；但RIP1+IRI组、RIP2+IRI组、RIP3+IRI与IRI组相应指标比较差异不明显，无统计学意义(P>0.05)；RIP4+IRI组血清Scr水平、肾小管Paller法评分，与IRI组相比明显好转，有统计学差异(P<0.05)。综合以上，确定本实验RIP保护肾脏早期热IRI的模型为：双侧股动静脉阻断血流5min，松开5min，重复4次，接着左肾蒂钳夹60min后再灌注2h。
　　 4.CD8+CD28-T淋巴细胞及相关因素在KIP、RIP保护大鼠肾脏早期热IRI过程中的变化血清Scr值IRI组血清Scr高于KIP+IRI组、RIP+IRI组、Sham组(P<0.05)；KIP+IRI组、RIP+IRI组血清Scr也存在增高，与Sham组相比有统计学差异(P<0.05)，但此两组间比较无统计学差异(P>0.05)。
　　 血清IL-10水平KIP+IRI组、RIP+IRI组血清IL-10浓度均高于IRI组、Sham组(P>0.05)；IRI组IL-10浓度与Sham组相比无统计学差异(P>0.05)；KIP+IRI组、RIP+IRI组间血清IL-10水平比较无统计学差异(P>0.05)。
　　 外周血CD8+CD28-T淋巴细胞比例KIP+IRI组、RIP+IRI组外周血CD8+CD28-T淋巴细胞比例均高于IRI组、Sham组(P>0.05)；KIP+IRI组与RIP+IRI组间、IRI组与Sham组间外周血CD8+CD28-T淋巴细胞比例相比没有统计学差异(P>0.05)。
　　 外周血CD28+T淋巴细胞比例IRI组外周血CD28+T淋巴细胞比例高于KIP+IRI组、RIP+IRI组、Sham组(P>0.05)；KIP+IRI组、RIP+IRI组外周血CD28+T淋巴细胞比例也存在增高，与Sham组相比有统计学差异(P>0.05)；KIP+IRI组、RIP+IRI组间CD28+T淋巴细胞比例比较无统计学差异(P>0.05)。
　　 外周血CD8+CD28+T淋巴细胞比例各组外周血CD8+CD28+T淋巴细胞比例均相差不多，各组间两两比较均无统计学意义(P>0.05)。
　　 外周血CD8+CD152+T淋巴细胞比例KIP+IRI组、RIP+IRI组外周血CD8+CD152+T淋巴细胞比例均高于IRI组、Sham组(P>0.05)；KIP+IRI组与RIP+IRI组间、IRI组与Sham组间外周血CD8+CD152+T淋巴细胞比例相比没有统计学差异(P>0.05)。
　　 外周血CD8-CD152+T淋巴细胞比例KIP+IRI组、RIP+IRI组外周血CD8-CD152+T淋巴细胞比例均高于IRI组、Sham组(P>0.05)；KIP+IRI组与RIP+IRI组间、IRI组与Sham组间外周血CD8-CD152+T淋巴细胞比例相比没有统计学差异(P>0.05)。
　　 外周血CD8+T淋巴细胞比例本实验运用不同荧光标记的抗大鼠-CD8抗体(FITC-rat-CD8a、PE-rat-CD8a)检测结果显示KIP+IRI组、RIP+IRI组外周血CD8+T淋巴细胞比例均高于IRI组、Sham组(P>0.05)；KIP+IRI组与RIP+IRI组间、IRI组与Sham组间外周血CD8+T淋巴细胞比例相比没有统计学差异(P>0.05)；不同荧光标记组间各相关指标水平相当，相互间比较无统计学差异(P>0.05)。
　　 肾小管损害程度Paller法评分IRI组肾小管Paller法评分高于KIP+IRI组、RIP+IRI组、Sham组(P<0.05)；KIP+IRI组、RIP+IRI组肾小管Pallet法评分也存在增高，与Sham组相比有统计学差异(P>0.05)，但此两组间比较无统计学差异(P>0.05)。
　　 KIP+IRI、RIP+IRI组外周血CD8+CD28-T淋巴细胞比例与其它指标相关性KIP+IRI、RIP+IRI组中CD8+CD28-T淋巴细胞比例与血清IL-10浓度、外周血CD8+T(PE/FITC)淋巴细胞比例、CD8+CD152+T淋巴细胞比例呈正相关(r=0.701、r=0.877/0.858、r=0.706；p<0.05)；与外周血CD28+T淋巴细胞比例、血清Scr值、肾小管损害程度Paller法评分均呈负相关，(r=-0.695、r=-0.801、r=-0.785，P<0.05)；与外周血CD8+CD28+T淋巴细胞、CD8-CD152+T淋巴细胞比例无相关性(r=0.268，r=0.204，P>0.05)。
　　 结论：
　　 1.成功建立RIP保护大鼠肾脏早期热IRI的实验模型。为今后的相关研究提供了一些参考资料。
　　 2.KIP、RIP两种不同的缺血预处理方式保护大鼠肾脏早期热IRI中肾脏功能的效应中存在相似的免疫细胞间平衡对抗机制。
　　 3.外周血CD28+T淋巴细胞比例在IRI组中增多、在KIP+IRI组和RIP+IRI组中降低、外周血CD8+CD28-T淋巴细胞比例在IRI组、Sham组相似、各组中CD8+CD28+T淋巴细胞变化不大，这些结果间接提示造成大鼠肾脏早期热IRI中肾脏功能损害的免疫细胞主要是CD4+CD28+T淋巴细胞。
　　 4.血清IL-10浓度在KIP+IRI组和RIP+IRI组中增高可能有两层含义①参与激活外周血CD8+CD28-T淋巴细胞②直接作为效应子发挥免疫抑制作用。但具体机制及与外周血CD8+CD28-T淋巴细胞相互因果关系有待进一步探讨。
　　 5.外周血CD8+CD28-T淋巴细胞参与介导了不同缺血预处理方式保护大鼠肾脏早期热IRI中肾脏功能的效应，可能作用机制分析如下：
　　 6.不同的预处理方式(KIP、RIP)引起大鼠外周血中各种抑制性蛋白物质(如：IL-10等)及危险信号(相当于内生性抗原)增多，激活抗原非特异性免疫调节细胞--CD8+CD28-T淋巴细胞增殖，通过①其表面增多的抑制性分化抗原CD152与IRI中起损害作用的CD4+CD28+T淋巴细胞表面的CD28竞争表达在缺血器官组织血管内皮细胞表面的共同配体B-7，从而阻断CD4+CD28+T淋巴细胞激活所需的CD28/B-7共刺激信号通路，进而减少CD4+CD28+T淋巴细胞活化及增殖，达到保护大鼠肾脏早期热IRI中肾脏功能的效应②分泌抑制性细胞因子--IL-10，以细胞间非接触的方式发挥免疫抑制作用，起到保护大鼠肾脏早期热IRI中肾脏功能的效应。