免疫清零耐受诱导治疗1型糖尿病—NOD小鼠动物实验研究

摘要

1型糖尿病（Type1 Diabetes，T1DM）是一种T细胞介导为主的器官特异性的自身免疫性疾病（Autoimmune desease，AID），在病毒感染、理化因素等作用下，机体的免疫平衡状态被打破，对自身抗原的免疫耐受丧失，机体产生自身抗体和/或自身致敏淋巴细胞，导致胰腺β细胞进行性破坏，胰岛素分泌不足而引起一系列临床症状的疾病。 TIDM目前确切的发病机制尚不清楚，认为与自身免疫反应启动和自身免疫耐受的丧失有很大关系，研究发现CD4+CD25+调节性T（Treg）细胞在其中发挥重要功能，其表达水平与TIDM的发病有关，也与病情进展有关。Treg细胞具有免疫耐受和免疫抑制双重功能，正常表达下可以抑制自身免疫反应，维持机体内稳态的平衡。 研究目的: 对已发病的NOD小鼠行免疫清零联合耐受诱导治疗后观察其疗效，鉴于Treg细胞在TIDM发病和疾病进展中的重要性，本动物实验来观察该模式治疗后Treg细胞表达水平的变化，进一步探讨该治疗模式与Treg细胞的相关性，从而探索其可能的作用机制。 研究方法: 1.实验动物; 20只健康雌性8～10周龄NOD小鼠，南京大学模式动物研究所（许可证编号：SCXK（苏）2005-0002）提供，于南方医院实验动物中心SPF级无菌环境实验室饲养（许可证编号：SCXK（粤）2006-0015），高脂高蛋白喂养，保持环境安静、清洁。 从20只小鼠中随机选择18只进入实验，平均分为3组，A组为空白对照组，B组为小剂量环磷酰胺（Low-dose Cyclophosphamide，LD-CTX）组，C组为移植剂量的环磷酰胺联合小剂量白舒非（HD-CTX+BU）组，并继之环孢素A（Ciclosporin A，CSA）行耐受诱导。 实验过程中动物死亡或造模不成功，另随机取同样条件下的NOD小鼠相同的实验条件和步骤差额补齐。 2.试验路线设计; 当NOD小鼠连续2次不同时间点血糖浓度≥11.3mmol/L，即为模型成功进入实验，各组在处理前外周血白细胞、淋巴细胞，餐后2h血糖、血清C肽，动物的体重、周龄无显著性差异。 A组：新发病的NOD小鼠给与同B、C组等量的生理盐水腹腔注射，当血糖高于30.0mml/L给与皮下注射胰岛素控制，避免血糖过高导致动物死亡。 B组：新发病的NOD小鼠给LD-CTX90mg/kg.d（相当于人用量10mg/kg.d）腹腔注射，每天1次，连续应用3天，给药期间及给药后监测血糖，当血糖高于30.0mml/L时，处理同A组。 C组：新发病的NOD小鼠给与HD-CTX联合BU腹腔注射给药，d1-3给与HD-CTX，d4-6给与小剂量BU，d7开始至死亡或实验结束给与CSA，给药期间及给药后监测血糖，当血糖高于30.0mml/L时，处理同A组。 给药方法： CTX：d1-3给与360 mg/kg.d（相当于人用量40mg/kg.d），每日1次；BU：d4-6给与7.2 mg/kg.次（相当于人用量0.8mg/kg/次），12小时一次，连续给药6次；CSA：自d7始给与27mg/kg.d（相当于人用量3mg/kg.d），每天1次。免疫清零：给药结束后（第7天）镜下计数外周血白细胞和淋巴细胞，目标：淋巴细胞计数趋近为零。 3.实验指标测定; 3组小鼠发病初给药前（第1天）及治疗后2周取外周血测定餐后2h血清C肽浓度、外周血CD4+CD25+调节性T（Treg）细胞的表达水平；并在第1天、第7天镜下计数外周血白细胞、淋巴细胞比例；实验结束或动物死亡后立即取小鼠胰腺和脾脏，胰腺HE染色观察胰岛的破坏情况；用流式细胞仪测定脾脏Treg细胞表达水平。 数据统计学分析： 本实验纳入NOD小鼠18只，18只实验数据进入结果分析。本实验数据应用SPSS13.0统计软件进行处理，结果用均数±标准差，治疗后2h-CP、外周血Treg细胞表达水平比较采用协方差分析（analysis of covariance，ANCOVA），脾脏Treg细胞表达水平的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），每组治疗前后指标的观察采用配对样本t检验（Paired-Samples T Test），以P≤0.05为差异有统计学意义。 研究结果: 1.实验动物观察; 1.1,小鼠发病初期异常活跃，饮水、进食增加、活动度较好。 1.2,给药期间及给药后小鼠观察; A组饮水、进食、活动度及毛色等逐渐变差。自16天开始陆续死亡，最长生存时间19天，中位生存时间18天。 B组给与LD-CTX期间活动尚可，进食、饮水无明显变化，给药结束第2天开始小鼠毛色、进食、饮水都变差，15天始小鼠陆续死亡，最长生存时间19天，中位生存时间17天。 C组给与HD-CTX期间就已开始出现毛色变差，脱毛，弓背，消瘦，倦怠，活动明显减少，对刺激反应较差，进食、饮水量明显减少，给与CSA上述情况无明显改善，实验过程中观察到3例会阴部有血块，自16天开始陆续死亡，最长时间19天，中位生存时间18.5天。 1.3,实验过程中无1例血糖超过30.0mmol/L。A组血糖波动，介于15-25mmol/L；B组给药后血糖持续升高；C组血糖给药后血糖波动，但较前无明显升高，死前有2例测血糖偏低（1.9 mmol/L、2.1 mmol/L）。 2.第7天免疫清零效果：C组WBC：（0.20±0.07）G/L；LYM（0.09±0.07）G/L，基本达到免疫清零效果。 3.空白对照组发病2周后指标观察; 新发病的NOD小鼠观察2周后餐后2h血清C肽（2h-CP）、Treg细胞的表达水平、Treg/CD4+T都较发病初期偏低，但无显著统计学意义（P=0.144；P=0.221； P=0.430）。 4.新发病的NOD小鼠给与LD-CTX方法治疗2周后的疗效观察; 4.1, LD-CTX治疗后发现2h-CP、Treg细胞的表达水平及Treg/CD4+T较治疗前显著降低（P=0.002；P=0.013； P=0.018）。 4.2, LD-CTX治疗2周后2h-CP与对照组相比无显著下降（P=0.158）；Treg细胞的表达水平（1.20±0.39）与对照组（1.78±0.29）相比有显著降低（P=0.015）；Treg/CD4+T无显著统计学差异（P=0.098）。 4.3, LD-CTX治疗后脾脏的Treg细胞表达水平与空白组相比无显著统计学差异（P=0.774）；治疗后Treg/CD4+T%（7.38±3.61）较空白组（9.06±4.87）无显著下降（P=0.357）。 5.新发病的NOD小鼠给与HD-CTX+BU并CSA耐受诱导治疗2周后的疗效观察 5.1,给与HD-CTX+BU并CSA耐受诱导治疗后2周发现2h-CP、Treg细胞的表达水平及Treg/CD4+T较治疗前显著增高（P=0.030； P=0.045； P=0.015）。 5.2,治疗2周后2h-CP、Treg细胞的表达水平及Treg/CD4+T的比值较对照组明显增高（P=0.001；P=0.002；P=0.019），也较LD-CTX治疗组显著升高（P=0.000； P=0.000； P=0.011）。 5.3,治疗后脾脏的Treg细胞表达水平及Treg/CD4+T细胞均较对照组有明显升高（P=000；P＝0.005），也明显高于LD-CTX治疗组（P=000；P＝0.001）。 结果显示：给与移植剂量的CTX联合小剂量BU并行CSA诱导后，小鼠餐后2h血清C肽分泌较给药前及空白组都显著升高，提示残存胰岛β细胞的功能较治疗前增强，胰腺β细胞的功能恢复。 6.胰腺HE染色胰岛观察; A、C两组腺泡基本完整，与B组相比胰岛破坏程度较轻，炎性细胞浸润较少，甚少出现胰岛的局部坏死。B组胰岛炎性细胞浸润较明显，胰岛破坏程度最重，取材肉眼观可见到胰腺糜烂。 研究结论: 1.NOD小鼠是一个很好的T1DM实验动物模型，移植剂量的CTX联合小剂量BU基本达到免疫清零的效果。 2.新发病NOD小鼠LD-CTX治疗后2h-CP、Treg等表达较治疗前下降，治疗后也较空白组下降，胰腺组织病理中也观察到胰岛的炎性细胞浸润和破坏较其他组严重，认为LD-CTX对TIDM无治疗作用，反加速T1DM的进展，分析其可能的作用机制是：通过降低Treg细胞的表达来间接发挥自身免疫增强效应，可能是LD-CTX加速TIDM的原因之一。 3.新发病NOD小鼠HD-CTX+BU并CSA耐受诱导治疗后2h-CP、Treg细胞等表达较治疗前明显增加，治疗后也较空白组明显升高，认为给新发病的NOD小鼠HD-CTX+BU继之给与CSA诱导短期治疗效果好，可以延缓TIDM的进展。认为其可能的有效作用机制是：一移植剂量的化疗以“大扫荡”方式清除了病态异反应的克隆细胞，终止了自身免疫反应；二免疫调节剂CSA或许通过增加CD4+CD25+调节性T细胞的表达和活性，重新诱导了新生免疫系统对自身抗原的耐受。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

第一节实验材料

1.1实验动物

1.2主要试剂与药品

1.3主要仪器和器械

1.4主要试剂的配制

第二节实验方法

2.1实验动物分组及处理

2.2实验路线设计

2.3实验指标

2.4主要的操作

2.5统计学处理

第三节实验结果

1.实验动物观察

2.第7天免疫清零效果

3.空白对照组2周后指标观察

4.新发病的NOD小鼠给与LD-CTX方法治疗后的疗效

5.新发病的NOD小鼠给HD-CTX+BU并CSA耐受诱导治疗后的疗效

6.胰腺HE染色结果

第四节讨论

第一部分空白组T1DM小鼠的指标观察

第二部分LD-CTX治疗新发病NOD小鼠后疗效及指标的观察

第三部分免疫清零耐受诱导治疗新发病NOD小鼠后疗效及指标的观察

本实验的不足

全文小结

附图

参考文献

附录中英文缩写词对照表(Abbreviation)

CD4+CD25+调节性T细胞与自身免疫性疾病(综述)

致谢

统计学证明