ADAM33基因T2、S2位点单核苷酸多态性与哮喘的相关性研究

摘要

研究背景及目的: 支气管哮喘（哮喘）是一种复杂的多基因疾病，具有明显的遗传倾向，呈家族聚集性，它的发生、发展由患者遗传易感性和环境暴露相互作用所决定。目前国内外对哮喘已经进行了大量的研究，越来越多的研究者致力于该疾病的遗传病因学研究，到目前为止已有大量研究试图探查哮喘人群的易感基因，希望通过对哮喘易感基因的确定帮助人们更好的了解哮喘的病理发生，同时也为寻找有效的哮喘治疗方案提供线索。ADAM33（A disintegrin and metalloproteinase33）基因单核甘酸多态性（singlenucleotide polymorphisms，SNPs）是近年来研究的较多的一个热点。ADAM33蛋白最初在细胞膜上发现，是一种膜锚定金属蛋白水解酶，由于他们具有解整合素结构域和金属蛋白酶结构域两个功能区，因而称为解整合素-金属蛋白酶。单核甘酸多态性是由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换、颠倒及单个碱基的缺失和插入。2002年Van Eerdewegh等对来自于美国和英国的460个哮喘家系进行了全基因扫描，确定染色体20p13上存在着与哮喘及气道高反应性（airway hyperresponsiveness，AHR）密切相关的候选基因。随后他们应用相关分析法对这一区域的23个基因的135个SNPs进行了分析，发现了有3个基因的24个SNPs与哮喘和AHR相关，而其中有14个SNPs位于ADAM33基因上，且主要相关的SNPs位于ADAM33基因的3'端，因此确定ADAM33基因是与哮喘和A HR相关的易感基因。从遗传学角度来说，遗传具有种族特异性。在不同种族中，同一个SNP分布频率不同，且对哮喘的影响也不尽相同。已有许多研究者通过病例对照分析，单体型分析及家系资料传递不平衡检验（TDT）等方法，探讨了ADAM33基因SNPs与哮喘易感性、病情严重程度、肺功能、变应性体质等各方面的关联，得出的结果不全部相同，并未见某种SNP位点在所有种族均有相关性的报道。ADAM33基因的功能和作用目前还不十分清楚，但根据它在间质细胞的选择性表达，其活性的改变必然导致气道平滑肌细胞和成纤维细胞功能的异常，因此推测与AHR和气道重塑有关。 人类ADAM33基因内部共有179个SNP位点，其中25个位于编码区（5个为同义突变，20个为无义突变），该基因多态性与中国汉族人群的哮喘相关性报道较少，本研究采用病例对照研究方法，以中国汉族人群正常个体和哮喘患者为研究对象，采用直接测序的方法探讨ADAM33基因多态性与中国汉族人群的哮喘之间的相关性。 材料与方法: 根据中华医学会呼吸病分会哮喘学组[3]制定的哮喘诊断标准，在我院门诊和住院部随机收集了186份临床诊断为哮喘的病例外周血作为哮喘组，150例健康体检者的外周血作为正常对照组。其中哮喘组男性95人，女性91人，平均年龄47.78岁；有71名患者进行过肺功能检查；在186名患者中有159人外周血EOS升高，并有过敏性鼻炎病史。对照组中男性78人，女性72人，平均年龄41.92岁。经询问和查体确认健康体检者没有哮喘类症状，如突然发作性气喘，呼吸困难或长期慢性咳嗽等。所有研究对象均知情同意。两组研究对象均为中国汉族人群，经比较两组对象年龄、性别均无显著性差异。提取外周血DNA作研究对象，用PCR扩增ADAM33基因的两个SNP位点（S2、T2）后进行直接测序。通过SPSS13.0计算，两样本均数的比较采用t检验，遗传H-W平衡定律检验根据遗传公式计算，组间等位基因型或等位基因的比较采用x2检验，不同病情严重程度之间采用非参数检验，肺功能之间比较采用方差分析；用单变量logistic回归分析SNPs与哮喘的相对危险度，以P<0.05为差异有统计学意义。 结果: 1.哮喘组和对照组年龄之间比较采用t检验，t值为0.486，P值为0.627，结果如表1所示，两组之间年龄无显著性差异。 2.哮喘组和对照组性别之间的比较采用X2检验，X2值为0.028，P值为0.866，结果如表2所示，两组之间性别无显著性差异。 3.ADAM33基因T2位点CC、CT、TT基因型在哮喘组的分布频数分别为139、47、0。根据Hardy-weinberg平衡检验公式X2=（O-C）2/C计算X2值为3.74，P值大于0.05，基因型分布符合Hardy-weinberg平衡定律。同理计算S2位点X2值为2.01，P值大于0.05，基因型分布符合Hardy-weinberg平衡定律，结果见表3。在对照组中分别对T2、S2位点根据Hardy-weinberg平衡检验公式X2=（O-C）2/C计算X2值分别为0.998和1.43，P值均大于0.05，结果见表4，基因型分布也符合Hardy-weinberg平衡定律，说明两样本具有很好的均衡性。 4.对T2位点，未检测到TT基因型，主要的原因可能是样本量不足。病例组和对照组中，等位基因T的频率分别为12.6%和7.6%，见表12，经X2检验P=0.026，见表5；对S2位点，病例组和对照组中，等位基因C的频率分别为24.8%和16.3%，见表12，经X2检验P=0.021，见表5。说明两SNP位点病例组和对照组的基因型构成差别有统计学意义，表明T2，S2位点SNPs与哮喘易感性有关。 5.根据病情严重程度把哮喘患者分为轻、中、重3组，经非参数检验分析，T2位点Z值为-0.13，P=0.897，见表6；S2位点X2值为0.419，P=0.811，见表7。结果表明T2，S2位点多态性与哮喘病情严重度无统计学相关。 6.通过logistic回归计算两位点单核甘酸多态性对哮喘的相对危险度，T2位点的OR值为1.867，P值为0.027； S2位点的OR值为0.444，P值为0.024；结果如表8所示，说明两SNPs位点能显著增加哮喘发生的危险性。 7.根据患者的外周血常规检测和询问有无使用药物史，把患者分为EOS增高和EOS不增高两组，通过X2检验分析2组对象的基因型构成，T2位点X2=2.316，P=0.128； S2位点X2=4.404，P=0.111；结果表明两SNPs位点基因型构成与EOS改变无统计学关联，单核甘酸多态性不能影响EOS。 8.方差分析计算基因型构成和肺功能指标FEV1实/预、FEV1/FVC和FVC实/预的关联，T2位点的P值分别为0.432，0.546，0.538； S2位点的P值分别为0.640，0.427，0.738，表明T2，S2位点的SNPs与肺功能指标无显著相关性。 结论: 被检测的ADAM33基因的T2，S2位点SNPs与中国汉族人群支气管哮喘的易感性有显著相关性，罕见等位基因能增加哮喘发生的危险，但与变应性体质和肺功能没有显著相关性。今后的工作将通过进一步扩大病例数和选取更多的位点来探讨ADAM33基因单核甘酸多态性与中国汉族人群支气管哮喘的关联和在哮喘发病机制中的作用。

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