复合FK506/NGF/RGD多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)缓释膜应用于同种异体神经移植的实验研究

摘要

一、研究背景与目的 由于创伤、肿瘤等致大段周围神经缺损、变性、坏死等临床上较为常见。治疗上往往需要移植物来桥接、促进和引导神经再生。一直以来自体神经移植是修复周围神经缺损最理想的手术方法，在临床上已广泛应用，也是衡量各种神经桥接材料的“金标准”。但往往会造成供体神经支配区感觉、功能障碍，且自体神经来源有限。同种异体神经移植可以解决上述问题，但如何降低或消除免疫排斥反应并加速神经生长是临床工作者和基础科研人员所面临的难题。本实验针对上述两个难题，用RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸Arg-Gly-Asp）高分子材料并加入FK506（免疫抑制剂）、NGF（神经生长因子）合成缓释膜外用于移植段神经周围，探讨其促进神经再生的效果。 二、方法 1、选取8只健康成年SD雄性大鼠，体重180～200g，在显微镜下分离并切取双侧坐骨神经，制成10mm神经段，用干燥无菌试管分装置于-196℃液氮中，保存3周，术前取出后常温复温。 2、选取体重180～200g，雄性SD大鼠40只为受体，随机分为4组，每组10只。A组：单纯冷冻异体神经移植组；B组：冷冻异体神经联合应用FK506/RGD复合缓释膜移植组；C组：自体神经移植组；D组：冷冻异体神经联合应用FK506/NGF/RGD复合缓释膜移植组。用浓度为0.4%的戊巴比妥钠（40mg/kg）注入腹腔麻醉大鼠。麻醉满意后，将大鼠俯卧固定于手术板上。左股后外侧区备皮，常规术野消毒、铺巾。沿左大腿后外侧作纵行切口，切开皮肤及皮下组织。钝性分离股二头肌与半腱肌、半膜肌，充分暴露坐骨神经，在距梨状肌下缘下5mm处切断并切除坐骨神经10mm，然后移植已处理的供体神经。B组移植段神经外用FK506/RGD复合缓释膜包裹，D组外用FK506/NGF/RGD复合缓释膜包裹，缓释膜两端分别固定于神经外膜上。术后分笼喂养12周。 3、术后对各组大鼠进行大体观察，于术后12周先进行神经电生理学检测，然后取双侧小腿三头肌进行恢复率测定、最后分别在光镜和电镜下对移植段神经进行组织形态学观察及超微结构测定。 三、结果 1.大体观察：术后1周内各组大鼠行动困难，精神萎靡，进食少，各组动物手术切口均未发生感染。术后第2周各组大鼠均不同程度地出现术侧小腿及部分足趾出现红肿甚至溃疡，第8周时所有大鼠足底的红肿和溃疡均消退。术后4周时各组大鼠术侧腿部肌肉出现不同程度的萎缩。术后8周时B、C、D组大鼠术侧萎缩的肌肉开始恢复，其中D组大鼠恢复最为明显。术后12周术取材时显露移植段神经，除A组与周围组织有粘连外，其余各组与周围组织界限清晰，且神经吻合口光滑，连续性良好，粗细均匀，质地柔软，显微镜下可清楚地观察到神经外膜丰富的新鲜血管。缓释膜已明显变脆、变薄。 2.电生理检测：各组运动神经传导速度的测定结果经统计分析显示：四组之间有统计学差异（F=26.190，P=0.000），D组优于A、B、C组（P<0.05，差异有统计学意义）；B、C组优于A组（P<0.05，差异有统计学意义）；B、C两组相比较无显著性差异（P=0.348>0.05，差异无统计学意义）。 3.小腿三头肌湿重恢复率测定结果：术后12周，所有大鼠术侧即左侧小腿三头肌均有萎缩，小腿三头肌恢复率测定结果经统计分析显示：四组之间有统计学差异（F=19.132，P=0.000），D组优于A、B、C组（P<0.05，差异有统计学意义）；B、C组优于A组（P<0.05，差异有统计学意义）；B、C两组相比较无显著性差异（P=0.351>0.05，差异无统计学意义）。 4.HE染色：术后12周移植段神经制作切片，HE染色显示：A组神经神经束膜比较模糊，再生神经纤维数目较少、轴突排列分布零散，走向紊乱；B、C两组神经神经束膜比较清晰，再生神经纤维数目较多、轴突排列分布比较均匀，走向基本一致；D组神经神经束膜清晰，再生神经纤维数目最多、且清晰可见，轴突排列整齐规则，分布均匀，走向一致。 5.亚甲蓝髓鞘染色：术后12周，移植段神经行半薄切片，亚甲蓝髓鞘染色显示：A组神经纤维密度稀疏，大小不均匀，髓鞘厚度薄，形状各异；B、C两组神经纤维密度较大，大小相对均匀，有髓神经多；D组神经纤维密度最大，有髓神经较多，髓鞘较厚，多呈圆形。 6.图像分析：术后12周，图像分析显示：四组之间的有髓神经纤维数目、轴突直径、髓鞘厚度差异均有统计学差异（F=194.918，P=0.000；F=54.342，P=0.000； F=109.294，P=0.000；），D组有髓神经纤维数目、轴突直径、髓鞘厚度均大于A、B、C组（P<0.05，差异有统计学意义）；B、C组有髓神经纤维数目、轴突直径、髓鞘厚度均大于A组（P<0.05，差异有统计学意义）；B、C两组有髓神经纤维数目、轴突直径、髓鞘厚度相比较均无显著性差异（P=0.058>0.05； P=0.412>0.05 P=0.219>0.05差异均无统计学意义）。 7.S-100免疫组化染色：术后12周移植段神经制作切片，S-100免疫组化染色显示：A组、B组、C组、D组再生神经S-100免疫组化染色均呈阳性。其中D组阳性反应最强，B组、C组阳性反应较强，A组阳性反应最弱。 8.透射电子显微镜下超微结构：术后12周，移植段神经行超薄切片，铀-铅复染色显示：A组图片视野里可见结蒂组织无定形结构中夹杂着变性神经纤维，其髓鞘厚薄不一，雪旺氏细胞器及有髓轴突稀少，部分再生轴突髓鞘馈变；B、C组图片视野里可见较多神经纤维髓鞘增厚和比较丰富的雪旺氏细胞器，正常成熟神经纤维与变性神经纤维共存，比例相当：D组图片视野里可见大量神经纤维髓鞘增厚和丰富的雪旺氏细胞器，且正常成熟神经纤维居多。 四、结论 通过移植段神经局部运用含有免疫抑制剂（FK506）、神经生长因子（NGF）、RGD多肽接枝聚的缓释膜，不仅能够起到抗免疫排斥反应的效果，而且在很大程度上提高了神经生长速度，其各项检测结果好于其它各实验组，甚至有些指标已经超过了自体移植组。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章复合FK506／NGF／RGD多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)缓释膜制备与生物学评价

1.1 RGD多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)的制备

1.2复合FK506／NGF／RGD缓释膜制备

1.3复合膜的形貌观察

1.4复合FK506／NGF／RGD缓释膜生物学评价

1.5讨论

1.6小结

参考文献

附图

第二章复合FK506／NGF／RGD多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)缓释膜应用于同种异体神经移植的实验研究

2.1引言

2.2实验材料

2.3实验方法

2.4检测指标

2.5统计学分析

2.6结果

2.7讨论

2.8小结

参考文献

附图

综述第三章同种异体神经移植的研究进展

3.1异体神经移植体中抗原成分

3.2宿主对异体神经移植的免疫排斥反应

3.3同种异体移植神经预处理方法

3.4免疫抑制剂在异体神经移植移植中应用

3.5展望

参考文献

成 果

致 谢