胃癌患者血清RASSF1A基因启动子区甲基化检测及临床意义

摘要

胃癌是世界范围内发病率第二位的肿瘤，估计占所有肿瘤的十分之一，其预后较差。在我国，胃癌是居于死亡率首位的肿瘤。上消化道内镜检查是目前公认的最有效的胃癌检查方法，但作为普查手段人群接受率较抵，而且对于小胃癌有一定的漏诊率。Ⅰ～Ⅲ期胃癌患者的治疗一般以手术为主，但晚期胃癌患者已失去手术机会，严重影响预后。因此，发掘新的诊断方法以提高胃癌早期诊断率就显得十分重要。遗憾的是，胃癌的诊断一直缺乏相对敏感和特异的肿瘤标志物。寻求新型的分子标记是提高胃癌早期诊断率的重要研究方向。近年来的研究提示许多抑癌基因启动子区域CpG岛的异常甲基化检测可能成为肿瘤早期诊断的分子标记。新近研究表明，新型候选抑癌基因Ras相关区域家族1A（Ras association domain family1 A，RASSF1A）启动子区域CpG岛的异常甲基化是抑癌基因失活的主要机制，在胃癌的发生、发展中起着重要作用。新近的研究表明，在胃癌患者的肿瘤组织、血液中均能检测到较高频率的RASSF1A基因启动子异常甲基化，并且甲基化频率与胃癌患者的临床病理参数之间存在着一定的相关性，提示RASSF1A启动子的异常甲基化在胃癌中具有一定的临床意义。随着循环核酸研究的兴起，已有研究证实血清抑癌基因甲基化研究具有一定的临床前景。目前胃癌患者血清RASSF1A启动子异常甲基化方面的研究十分有限，国内尚未见报道。 [目的] 以往的肿瘤标志物如CEA对胃癌诊断来说有很多的局限性。寻找新的肿瘤标志物为胃癌的早期诊断提供前景。本研究的主要目的是检测胃癌患者血清、肿瘤组织及癌旁组织RASSF1A基因启动子区异常甲基化情况，并探讨其与临床参数之间的关系，探讨其在胃癌早期诊断和预后评估中的可能作用。 [材料和方法] 甲基化特异性聚合酶链反应（methylation special PCR，MSP）是一种快速、敏感的基因甲基化检测方法，灵敏度高，可用于微量分析和同源基因分析，该方法不仅能避免限制性内切酶消化不完全所致的假阴性，而且假阳性率低，为检测血清离微量基因甲基化提供了可能。它将DNA先用重亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性的PCR。MS-PCR中设计两对引物，并要求：1.引物末端均设计至检测位点结束；2.两对引物分别只能与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲基化DNA链。检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；若用针对处理后的非甲基化DNA链的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化。本文以MSP法检测47例胃癌患者、30例胃良性病变患者和30名健康对照者的血清RASSFIA基因启动子区甲基化情况，并探讨其与临床参数之间的关系。其中16例胃癌患者同时留取手术切除癌组织、癌旁组织标本以及术前、术后血标本行对照研究。 [结果] 胃癌患者血清RASSF1A基因启动子区甲基化率为34.0%（16/47），胃良性病变患者甲基化率仅为3.3%（1/30），健康对照者均未发生甲基化；胃癌患者甲基化率显著高于胃良性病变患者和健康对照者（P=0.0015）。16例胃腺癌组织标本中5例（31.2%）检测到RASSF1A基因启动子区甲基化，1例（6.25%）癌旁组织亦出现甲基化；5例组织检测阳性标本中的4例（75.0%）术前、术后血清标本均检测到甲基化，癌组织甲基化阳性者的血清甲基化阳性率为80%。胃癌患者血清RASSF1A基因甲基化与性别、年龄、肿瘤分化程度、有无转移以及血清CEA水平均无相关性。有远处转移者甲基化率略高于无转移者，手术组甲基化率略低于未手术组，但差异均无统计学差异。 [主要结论] 本文使用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测47例胃腺癌患者、30例胃良性病变患者和30名健康对照者的血清RASSF1A基因启动子区甲基化情况，其中16例胃癌患者同时留取手术切除癌组织、癌旁组织标本以及术前、术后血标本行对照研究，并研究其与临床参数之间的关系。得出的结果如下果： 1）胃癌患者外周血血清DNA RASSF1A基因启动子区域CpG岛异常甲基化频率较高：胃癌患者血清RASSF1A基因启动子区甲基化率为34.0%（16/47），胃良性病变患者甲基化率仅为3.3%（1/30），健康对照者均未发生甲基化；胃癌患者甲基化率显著高于胃良性病变患者和健康对照者（P=0.0015）。 2）16例胃腺癌组织标本中5例（31.2%）检测到RASSF1A基因启动子区甲基化，1例（6.25%）癌旁组织亦出现甲基化；5例组织检测阳性标本中的4例（75.0%）术前、术后血清标本均检测到甲基化，癌组织甲基化阳性者的血清甲基化阳性率为80%。 3）胃癌患者血清RASSF1A基因甲基化与性别、年龄、肿瘤分化程度、有无转移以及血清CEA水平均无相关性。有远处转移者甲基化率略高于无转移者，手术组甲基化率略低于未手术组，但差异均无统计学差异。 因此血清RASSF1A基因启动子区域CpG岛甲基化状态的检测有望为胃癌的临床诊断及预后判断提供新的辅助手段。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 前言

2 材料和方法

2.1研究对象

2.2主要实验仪器

2.3主要实验试剂

2.4实验方法

2.5统计分析

3 结果

4 讨论

参考文献

实验附图

全文总结

文献综述 消化道肿瘤分子靶向治疗新进展

附录1在读期间所写文章

附录2致谢

研究生毕业论文统计学审稿证明