脑血管痉挛的基因发病机制及诊治的实验和临床研究

摘要

颅内动脉瘤破裂是自发性蛛网膜下腔出血(SAH)最常见的原因(占85％),而脑血管痉挛(CVS)是SAH最严重和常见的并发症,发病率高达30％～90％,是导致患者伤残和病死的主要原因之一。
　　 虽然在优先处理病因并积极清除蛛网膜下腔出血的基础上,应用尼莫同与法舒地尔等药物经静脉给药,可以缓解部分脑血管痉挛,但对严重脑血管痉挛病人给药的效果仍不满意。我们设计了经椎动脉内注射盐酸法舒地尔的实验研究,在活体动物模型中持续椎动脉内注射盐酸法舒地尔,观察其在不同时间点对蛛网膜下腔出血引起的迟发性脑血管痉挛的防治作用,并和静脉内给药对比。
　　 CVS是由各种物理和化学刺激等多因素共同作用于颅内动脉所致的一种异常收缩状态。明确其发病机制,从而探索有效的治疗方法是改善破裂出血的颅内动脉瘤患者整体预后和生活质量的关键,是目前国内、外研究的热点。为此学者们作了大量动物实验和临床研究,随着分子生物学技术的发展,对SAH导致CVS的分子机制进行了深入的探索性研究。但现有研究中动物模型制作困难,研究样本量小,且未进行全基因组筛选,其研究结果存在局限性。我们首次采用不同时间点重复样本基因芯片检测的方法对CVS早期基因表达谱进行了研究。
　　 本课题旨在从三方面研究CVS:
　　 第一部分:在活体动物模型中持续椎动脉内注射盐酸法舒地尔,观察其在不同时间点对蛛网膜下腔出血引起的迟发性脑血管痉挛的防治作用,并和静脉内给药对比。
　　 第二部分:脑血管痉挛是动脉瘤性蛛网膜下腔出血的严重并发症,其发病机制尚未完全明确。通过对兔脑血管痉挛动物模型早期基因表达谱的研究,从基因表达层面探讨脑血管痉挛的发病机制。
　　 第三部分:收集2010年3月至2011年3月于广州军区武汉总医院神经外科的自发性蛛网膜下腔出血后出现严重脑血管痉挛病人,观察术中及术后动脉注射盐酸法舒地尔对SAH后脑血管痉挛的疗效。
　　 第一部经椎动脉内持续注射盐酸法舒地尔治疗脑血管痉挛的实验研究
　　 目的:在活体动物模型中持续椎动脉内注射盐酸法舒地尔,观察其在不同时间点对蛛网膜下腔出血引起的迟发性脑血管痉挛的防治作用,并和静脉内给药对比。
　　 方法:日本大耳白兔被随机分为4组:7d组(A组)--首次注血后当天开始行椎动脉内持续注射盐酸法舒地尔(1mg/kg/24h)；5d组(B组)--首次注血后第3d(即第2次注血后1d)开始行椎动脉内持续注射盐酸法舒地尔(1mg/kg/24h)；静脉给药组(C组)--首次注血后当天开始行静脉滴注盐酸法舒地尔(0.5mg/kg,bid)；对照组(D组)--首次注血后当天开始行椎动脉内注射5％葡萄糖溶液。枕大池2次注血法建立蛛网膜下腔出血模型,椎动脉给药组经微量注射泵分别于不同时间点开始给予盐酸法舒地尔或5％葡萄糖溶液,静脉给药组经耳缘静脉滴注盐酸法舒地尔,注血前及注血后第5、7d各组均行脑血管造影及血管彩色超声检查,基底动脉痉挛的程度通过测算血管内径变化的比例以及基底动脉血流峰值速度变化的比例而得到评估。7d时处死动物取基底动脉,行光镜、电镜检查,观察其病理改变。
　　 结果:28只动物接受了试验,共进行了84次脑血管造影。D组发生了明显的基底动脉痉挛(第5天:(27.06±3.34)％,n=7；第7天:(24.98±4.19)％,n=7),动、静脉给予盐酸法舒地尔的各组均对蛛网膜下腔出血引起的基底动脉痉挛有显著保护作用。在第5天,静脉给药组与椎动脉5天给药组的保护作用无统计学差异(静脉给药组,15.43±4.82％,n=7；5天组10.37±6.92％,n=7),但与椎动脉7天给药组有统计学差异((2.02±6.21)％,n=7)；在第7天,椎动脉5天组与7天组的保护作用无统计学差异(5天组:(2.60±6.42)％,n=7；7天组:(0.44±5.12)％,n=7),但与静脉给药组有显著差异(8.40±4.28％,n=7)。同时用血管彩色超声多普勒对各组基底动脉峰值流速进行监测,并行光镜、电镜等病理检查,也支持上述结果。
　　 结论:脑血管痉挛动物模型中椎动脉内持续注射盐酸法舒地尔对蛛网膜下腔出血引起的脑血管痉挛的保护作用优于静脉内给药。
　　 第二部分兔脑血管痉挛动物模型早期基因表达谱研究
　　 目的:脑血管痉挛是动脉瘤性蛛网膜下腔出血的严重并发症,其发病机制尚未完全明确。通过对兔脑血管痉挛动物模型早期基因表达谱的研究,从基因表达层面探讨脑血管痉挛的发病机制。
　　 方法:采用不同时间点重复样本基因芯片检测的方法进行研究。取12只健康成年日本大耳白兔,体重(2800±120)g,随机分为对照组(D组)、3天组(C组)、5天组(B组)和7天组(A组),每组3只。D组仅进行2次枕大池穿刺注入等量生理盐水并行脑血管造影,A、B、C组行2次枕大池穿刺注入未抗凝自体动脉血,造影证实脑血管痉挛后建立动物模型。A、B、C组分别于各自时间点处死实验动物,分别获取基底动脉组织,采用Trizol法提取总RNA,用12张Agilent兔全基因4×44 K芯片进行检测。采用GeneSpring11.0统计软件,以P<0.05且倍数变化(fold change,FC)≥2筛选出差异表达基因。
　　 结果:成功建立兔脑血管痉挛动物模型并获得相应的组织标本。各组总RNA质量均能满足基因芯片检测要求。基因芯片结果显示:蛛网膜下腔出血早期许多基因发生表达变化,酪氨酸激酶、离子通道、A3腺苷受体等基因表达变化具有重要意义。
　　 结论:蛛网膜下腔出血早期脑血管痉挛的发病机制与众多基因表达水平变化密切相关。