GSK-3β抑制剂对原发和转移结肠癌细胞耐药性影响及机制研究

摘要

研究背景与目的：
　　 结直肠癌是一种常见恶性肿瘤,其发病率呈上升趋势,但治疗效果并未因多年的努力而得到明显改善,其中肿瘤多药耐药是影响肿瘤化疗疗效的一个重要因素。研究表明体内存在的实体肿瘤是一个三维的细胞群集体,其细胞间的相互作用使实体肿瘤耐药机制错综复杂,细胞间信号转导可能参与肿瘤细胞多药耐药的调控,为多药耐药机制的研究带来了新的思路。
　　 糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶,参与细胞增殖、分化和凋亡等多种重要生理过程,已成为备受关注的研究热点。研究表明GSK-3β是细胞内Wnt/β-链接素(β-catenin)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)及RB/E2F-1等众多信号传导通路的主要调控酶,通过对下游核转录因子的影响参与细胞增殖、凋亡的调控及肿瘤多药耐药的调控,但GSK-3β对肿瘤细胞生物学特性的影响以及GSK-3β能否成为肿瘤治疗的靶点目前仍存有较大争议,而且GSK-3β参与肿瘤多药耐药调控的机制尚不明确。因此,进一步研究GSK-3β在结直肠癌细胞生长及多药耐药机制中的作用具有重要的临床意义。
　　 肿瘤细胞多药耐药是指肿瘤细胞在接触某种化学治疗药物后,不仅对该种化疗药物产生耐药,同时对其他结构、功能和作用机制不同的化学药物也产生不同程度交叉耐药的现象。肿瘤多药耐药的形成机制错综复杂,目前比较受关注的耐药机制主要有:(1)调控细胞调亡进程的相关基因或蛋白的改变,导致肿瘤细胞对多种化疗药物诱导细胞凋亡的抵抗或逃避,如β-catenin、P53、Bcl-2等；(2)通过ABC(ATP binding cassette,ABC)跨膜转运蛋白作用增加药物外排,目前发现的ABC转运蛋白家族共有48个基因,与耐药相关的基因有:ABCA2、ABCB1(P-gp)、ABCC1(MRP1)、ABCC2(MRP2)、.ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCC6、ABCC11、ABCG2,其中ABCB1(P-gp)及ABCC2(MRP2)在结直肠组织有较高的表达；(3)激活药物解毒系统,如谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)系统的激活；(4)参与DNA复制、修复的蛋白酶改变,如拓朴异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)；(5)DNA合成关键酶,如胸苷酸合成酶(thaymidylate synthase,TS),TS是DNA合成及代谢过程的关键酶,也是结直肠癌基本化疗药物5-Fu的靶酶,TS表达的高低是影响5-Fu化疗敏感性的重要因素;(6)肿瘤干细胞耐药机制,肿瘤干细胞逃避化疗药物及靶向治疗的作用继续生存并可上调ABC转运蛋白的表达。
　　 新近在GSK-3β抑制剂与化疗药物联合用药的实验研究中发现GSK-3β抑制剂降低了部分化疗药物诱导细胞凋亡的作用,但机制尚不明确,在结直肠癌GSK-3β抑制剂对基础化疗药物5-Fu诱导的细胞凋亡有何作用尚未知,为了进一步研究GSK-3β对结直肠癌耐药性的影响及其调控机制,我们选择来源于同一结肠腺癌患者的原发灶SW480细胞及淋巴结转移灶SW620细胞作为研究对象,应用一种小分子ATP竞争性GSK-3β抑制剂(2'Z,3'E)-6-bromoindirubin-3'-oxime(BIO)作用于结肠癌SW480、SW620细胞,比较BIO作用前后原发及转移二种不同发展阶段的结肠癌细胞多药耐药蛋白P-gp、MRP2、TS及相关调控蛋白β-catenin、Bcl-2、E2F-1蛋白及mRNA含量变化,同期观测BIO对二种肠癌细胞生物学特性及5-Fu诱导细胞凋亡的影响并分析其机制,应用基因芯片及生物信息学分析BIO对二种肠癌细胞多药耐药相关基因表达的影响及调控机制。
　　 方法：
　　 1.GSK-3β抑制剂对原发和转移结肠癌细胞生物学特性的影响
　　 应用不同浓度GSK-3β抑制剂BIO作用于结肠癌SW480、SW620细胞,采用倒置显微镜观察BIO作用前后结肠癌SW480、SW620细胞生长情况并检测细胞内ATP浓度:采用流式细胞技术检测细胞周期及凋亡；Western blot检测β-catenin、E2F-1和Bcl-2蛋白表达；免疫细胞化学检测β-catenin、Ki-67及CyclinD1蛋白表达及细胞定位情况；HE染色及电镜观察细胞形态；Tunel染色观察凋亡细胞形态。
　　 2.GSK-3β抑制剂对原发和转移结肠癌细胞多药耐药相关蛋白表达的影响
　　 采用Western blot检测BIO作用前后结肠癌SW480、SW620细胞P-gp、MRP2、TS蛋白表达；免疫荧光双重标记β-catenin及P-gp、β-catenin及MRP2,共聚焦显微镜观察β-catenin与P—gp、MRP2共定位情况,并进行罗丹明123外排能力检测。
　　 3.GSK-3β抑制剂对5-Fu诱导原发和转移结肠癌细胞凋亡的影响
　　 采用流式细胞术检测不同浓度5-Fu诱导结肠癌SW480、SW620细胞凋亡情况,筛选适宜的5-Fu药物浓度；再采用流式细胞技术及Tunel染色技术检测5-Fu及5-Fu和BIO联合作用前后结肠癌SW480、SW620细胞凋亡情况。
　　 4.GSK-3β抑制剂对原发和转移结肠癌细胞耐药性影响的基因芯片检测及分析
　　 采用NimbleGen公司的人类基因组表达谱芯片(NimbleGen Human GeneExpression Microarrays)对BIO作用前后结肠癌SW480、SW620细胞进行基因芯片检测(45,033个基因),进行差异表达基因的筛选,分析多药耐药相关基因表达变化及调控机制。
　　 结果：
　　 1.GSK-3β抑制剂影响原发和转移结肠癌细胞生物学特性
　　 GSK-3β抑制剂BIO作用结肠癌SW480、SW620细胞后,细胞内ATP浓度适度升高。在SW480细胞,BIO明显上调β-catenin蛋白表达(F=33.250,P=0.000)、促进β-catenin核移位、下调E2F-1及Bcl-2蛋白表达(F=317.869,P=0.001；F=12.389,P=0.002)、降低细胞凋亡率(F=11.114,P=0.003)、增加Ki-67阳性表达率及S和G2/M期细胞数量,细胞形态呈高增殖状态,Cyclin D1表达变化不明显。在SW620细胞,BIO明显上调β-catenin及E2F-1蛋白表达(F=19.608 P=0.000；F=22.630,P=0.000)、促进β-catenin核移位、轻度下调Bcl-2蛋白表达、轻度降低细胞凋亡率、增加Ki-67阳性表达率,S和G2/M期细胞数量、细胞形态及Cyclin D1表达变化不明显。
　　 2.GSK-3β抑制剂影响原发和转移结肠癌细胞多药耐药相关蛋白的表达
　　 GSK-3β抑制剂BIO明显上调结肠癌SW480细胞P-gp、MRP2、TS蛋白表达(F=29.600,P=0.000:F=11.555,P=0.003:F=32.996,P=0.000)、也明显上调SW620细胞P-gp、MRP2、TS蛋白表达(F=26.792,P=0.000;F=17.657,P=0.001；F=92.953,P=0.000)、增强SW480和SW620细胞罗丹明123外排能力(P=0.027;P=0.038),P-gp、MRP2与β-catenin有较明显的共定位表达现象。
　　 3.GSK-3β抑制剂影响5-Fu诱导的原发和转移结肠癌细胞凋亡
　　 筛选出5-Fu作用于结肠癌SW480、SW620细胞的最佳浓度为50μmol/L,在SW480细胞,GSK-313抑制剂BIO明显降低5-Fu诱导的细胞凋亡(P=0.000),在SW620,GSK-3β抑制剂BIO仅轻度降低5-Fu诱导的细胞凋亡。
　　 4.GSK-3β抑制剂对原发和转移结肠癌细胞耐药性影响的基因芯片检测及分析
　　 从基因芯片检测结果中筛选出SW620与SW480细胞之间耐药相关差异表达基因有:GSTM1、TOP2A、ABCB7、ABCB7、ABCC2、TOP1、ABCA11、ABCB9。GSK-3β抑制剂BIO作用后,在SW480细胞上调的耐药基因有ABCB1,在SW620细胞上调的耐药基因ABCB1、ABCC2、ABCB10、TAP2、ABCE1。其中ABCB1、ABCC2经Real-time PCR检测验证,OSK-3β抑制剂BIO明显上调SW480细胞ABCB1 mRNA含量(F=6.451、P=0.016),明显上调SW620细胞ABCB1及ABCC2 mRNA含量(F=16.204,P=0.001；F=13.122,P=0.002)。
　　 结论：
　　 1.GSK-3β抑制剂BIO增加了结肠癌SW480和SW620细胞对5-Fu的耐药性,此作用在SW480细胞比SW620细胞明显。
　　 2.GSK-3β抑制剂BIO增加结肠癌SW480和SW620细胞耐药性的机制有:(1)凋亡抵抗增强;(2)P-gp、MRP2转运蛋白增多,功能增强；(3)TS蛋白增多；(4)细胞内ATP含量增多,可能有助于增强ABC转运蛋白的功能。其中凋亡抵抗在SW480高于SW620细胞。
　　 3.β-catenin、E2F-1与Bcl-2共同参与了BIO对结肠癌SW480和SW620细胞增殖凋亡及耐药性的调控,β-catenin在GSK-3β调控结肠癌细胞耐药性方面可能起到关键作用,E2F-1在SW480和SW620细胞表达的不同可能是二株细胞耐药性不尽相同的重要原因。
　　 4.在SW480和SW620细胞,GSK-3β抑制剂BIO上调P-gp、MRP2转运蛋白与β-catenin上调有关,而TS上调可能通过E2F-1或非E2F-1途径,其机制有待进一步研究。
　　 5.结肠癌SW480和SW620细胞之间存在差异表达基因,这些差异是二株细胞对GSK-3β抑制剂及GSK-3β抑制剂联合5-Fu作用产生不同反应的基础。
　　 创新点：
　　 1.证实GSK-3β参与结肠癌细胞耐药性的调控,提出并验证了GSK-3β参与结肠癌细胞耐药性调控的机制,为GSK-3β作为结肠癌耐药靶点的研究提供了重要的理论及实验依据。
　　 2.初步验证了β-catenin在结肠癌细胞凋亡及P-gp、MRP2转运蛋白调控中的作用,提出β-catenin在GSK-3β调控结肠癌细胞耐药性方面可能起到关键作用。
　　 3.发现GSK-3β抑制剂对原发灶和转移灶结肠癌细胞耐药性及耐药相关调控因子的影响有所不同,尤其是对E2F-1有相反的作用,提示GSK-3β在结肠癌的不同发展时期可能具有不同的功能,为GSK-3β在转移灶癌细胞耐药性方面的研究提供了新的线索。