不同抗凝剂血液灌流对脓毒症兔作用及安全性影响

摘要

背景:
　　 脓毒症(sepsis)指由于外伤、化脓症等各种原因导致化脓性病原菌及其毒素进入血液后，并大量繁殖，迅速顺着血液循环扩散至宿的其他组织或器官，并在这些组织器官中产生新的化脓性病灶，最后导致剧烈全身炎症反应等严重的临床综合征，患者被感染后继而出现机体内各组织器官功能的障碍及受损，最终可引发如脓毒性休克(septicshock)、多器官功能衰竭(multipleorganfailure，MOF)等严重的并发症，治疗不及时还能导致死亡。脓毒血症如并发了重症脓毒症及脓毒性休克的死亡率可以高达70％。在欧美发达国家每年仍有超过70万发生脓毒症患者，死亡率约为30-50％。在我国，由于脓毒症而出现严重并发症如多器官功能障碍综合症(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)而死亡的人数每年达到上百万之多。如何有效应对脓毒症是受到医学界的广泛关注。
　　 血液净化(bloodpurification)是指把患者血液引出体外并通过一种净化装置，除去其中某些致病物质，净化血液，达到治疗疾病的目的，这个过程即为血液净化。血液灌流(hemoperfusion，HP)治疗技术将病人动脉血流经管道引向灌流器，血液经过灌流器时受到吸附剂或其他生物材料的作用而得到净化或生化处理，灌流后的血液再经管路返回静脉。HA型树脂血液灌流器目前临床上已广泛用于脓毒症病人的治疗。
　　 过去研究一直认为，凝血功能障碍及弥漫性血管内凝血是脓毒血症终末期所产生的严重并发症之一，然而，随着研究的深入，发现在整个脓毒血症的发病过程中都存在这凝血功能障碍，而凝血功能障碍在脓毒血症的发生、发展及预后所起重要作用的观点受到研究人员的广泛认可。有研究显示，超过50％的脓毒血症患者伴有凝血因子数量或功能异常，DIC的发生率约为20％。因此，认为对脓毒血症患者的高凝状态应该及时早期纠正。
　　 但在脓毒症行血液灌流哪种抗凝剂效果更佳?目前在国内外尚无确定的答案。本文设想通过盲肠结扎穿孔法造成脓毒症兔模型，然后根据使用抗凝剂的不同，分组并分别对兔进行单次血液灌流，检测凝血酶原时间(prothrombintime，PT)、活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime，APTT)、凝血酶时间(thrombintime，TT)、纤维蛋白原(fibrinase，FIB)变化，并结合安全性，以找出脓毒症兔血液灌流最佳抗凝剂，从而为临床脓毒症病人血液灌流治疗的抗凝剂选择提供一个动物实验依据，以期改善脓毒症患者的预后。
　　 目的:
　　 通过检测兔血清中PT，APTT，TT，FIB随血液灌流选择抗凝剂不同而发生的变化，结合出血性事件，探讨脓毒症兔行血液灌流抗凝剂使用的最佳选择。
　　 方法:
　　 1)准备30只雄性实验兔，约2-2.5kg，购自南方医科大学医学实验动物中心。随机分为假手术组（6只）、手术组（6只）、水蛭素干预组（6只）、肝素干预组（6只）及枸橼酸钠干预组（6只）。
　　 2)运用盲肠穿孔术制作脓毒症兔模型，对手术区域进行常规的消毒并铺手术巾，行下腹部正中切口约3-5cm，打开腹壁进入腹腔后将盲肠远端与大肠系膜分离，游离盲肠。暴露盲肠后，在盲肠基底部和盲肠游离端距离的中部结扎，保留近端盲肠血供，在盲肠末端与结扎部位之间的中部，用15号针头(直径2.5mm)沿肠系膜侧向对侧穿孔并来回贯穿3次。将盲肠放回腹腔原位，逐层缝合腹壁切口，术后皮下注射0.9％生理盐水3mL，补充术中液体丢失。行股动静脉置管术以留待血液灌流的需要构成血液管路通道。
　　 3)各组在CLP术后12小时用自制血液灌流器行单次血液灌流，灌流时间为2小时，速度为5ml/min;假手术组行空灌流（用空灌流器灌流）作为实验对照。手术组进行造模和置管灌流，在管路预冲后不另行添加任何抗凝剂。肝素干预组，枸橼酸钠干预组及水蛭素干预组在血液灌流过程中分别应用肝素钠、枸橼酸钠和水蛭素，剂量分别为150IU/kg，2.5g/kg，3mg/kg，血液灌流中持续静脉滴注。取造模前，灌流第0分钟，灌流第10分钟，第30分钟，第60分钟，第120分钟为时间点检测凝血-抗凝指标PT，APTT，TT，FIB。
　　 4)兔固定在手术台上至死亡，定时观察兔精神、呼吸、心率、体温情况，并每天静脉补充液体，液体量按80ml/kg，包括0.9％生理盐水及10％葡萄糖溶液，总张力为1/4，记录生存时间记录兔状态，生存时间，有无出血事件。
　　 5)应用统计软件SPSSI7.0处理数据，计量资料用均数±标准误表示。重复测量数据采用重复测量数据的方差分析进行处理，不满足球形检验时采用Greenhouse-Geisser校正，组间单独效应分析采用One-wayANVOVA，多重比较采用Dunnett检验，P＜0.05为有统计学意义。
　　 结果:
　　 1)进行盲肠结扎穿孔术后的动物，处于嗜睡状态，不进食，刺激后可见痛觉反应，6-12h出现精神萎靡，倦怠，对刺激反应性减弱，毛发松乱等程度不同的中毒症状。术后约12小时均开始出现体温升高，精神倦怠、呼吸、心率逐渐增快等症状，均于术后48小时至90小时间死亡。初期脉搏为170-200次/min，呼吸为80-100次/min，进而出现脉搏呼吸抑制，粘膜创口出血。死亡动物尸解可见左下腹部出现脓肿包裹，腹腔有混浊渗出液，空肠充气，甚至坏疽，盲肠肿胀、粘连，穿刺针孔明显，肝、肾充血。CLP术后各时间点(12h、24h)所取的血液细菌培养标本中均检出大肠杆菌，阴性对照组细菌培养阴性。造模成功。
　　 2)盲肠结扎穿孔法建立动物脓毒血症模型后12小时开始2小时的灌流，造模前各组间的凝血酶原时间(PT)无统计学差异(F=6.721，P=0.101)，假手术组进行开腹后缝合并置管，不对盲肠进行结扎贯穿处理，仅作为阴性对照。手术组进行造模和置管灌流，在管路预冲后不另行添加任何抗凝剂。造模后12h，灌流0分钟再次测定凝血酶原时间，灌流各时间点仅假手术组无变化(F=0.820，P=0.547)，其余四组均显著地升高(P＜0.001)，与假手术组比较，有显著的统计学差异(p＜0.05);灌流第10分钟，测定PT，手术组PT仍进一步升高，达到33.72±3.05s，通过使用抗凝剂进行灌流，肝素组PT下降最快、水蛭素次之、枸橼酸钠下降最慢，与手术组比较，均有显著的统计学差异(p＜0.05);灌流第30分钟，手术组PT为32.90±2.10s，各抗凝组PT值与手术组比较，均有显著的统计学差异(p＜0.05);60分钟与120分钟两个时间点中，手术组发生灌流管堵塞，PT值无法检测出来;三种抗凝剂都随时间延长而PT值缩小，肝素最为显著，而枸橼酸钠则相对作用较缓，除手术组外，其余组别无出现DIC现象。
　　 3)造模前各组间的血浆凝血酶时间(TT)无统计学差异(F=11.809，P=0.100)，造模后12h，灌流0分钟再次测定血浆凝血酶时间，灌流各时间点仅假手术组无变化(F=0.000，P=0.993)，其余四组均显著地升高P＜0.001)，与假手术组比较，有显著的统计学差异(p＜0.001);灌流第10分钟，测定TT，手术组TT仍维持于96s以上，通过使用抗凝剂进行血液灌流，肝素组TT下降最快，幅度最大、水蛭素组与枸橼酸钠组相近，下降幅度较小，与手术组比较，均有显著的统计学差异(p＜0.05);灌流第30分钟，手术组TT为96.95±10.48s，各抗凝组PT值与手术组比较，均有显著的统计学差异(p＜0.05);60分钟与120分钟两个时间点中，手术组发生灌流管堵塞，TT值无法检测出来;三种抗凝剂都随时间延长而TT值缩小，肝素最为显著，而枸橼酸钠则相对作用较缓，除手术组外，其余组别无出现DIC现象。
　　 4)造模前各组间的部分凝血活酶时间(APTT)无统计学差异(F=0.962，P=0.446)，造模后12h，灌流0分钟再次测定部分凝血活酶时间，灌流各时间点仅假手术组无变化F=2.882，P=0.035），其余四组均显著地升高(P＜0.001)，与假手术组比较，有显著的统计学差异(p＜0.05);灌流第10分钟，测定APTT，除假手术组外，其余四组APTT仍维持于85s以上，通过使用3种不同抗凝剂进行血液灌流，肝素组APTT下降最快、水蛭素组与枸橼酸钠组相近，下降较慢，与手术组比较，有显著的统计学差异(p＜0.05);灌流第30分钟，手术组APTT为109.51±15.62s，3种不同抗凝剂组APTT值均下降到55s以下;60分钟与120分钟两个时间点中，手术组发生灌流管堵塞，APTT值无法检测出来;三种抗凝剂都随时间延长而APTT值缩小，肝素最为显著，而枸橼酸钠则相对作用较缓和，除手术组外，其余组别无出现DIC现象。
　　 5)造模前各组间的纤维蛋白原(Fib)无统计学差异(F=0.087，P=0.986)，造模后12h，灌流0分钟采血测定纤维蛋白原，灌流各时间点仅假手术组无变化(F=0.205，P=0.957)，其余四组均显著地升高(p＜0.001)，肝素组测得升高值最为显著，为6.22±0.55g/L，与假手术组比较，有显著的统计学差异(p＜0.05);灌流第10分钟，测定Fib，除假手术组外，其余四组Fib仍维持于6.9-3.2g/L，通过使用3种不同抗凝剂进行血液灌流，肝素组Fib下降幅度最大、水蛭素组次之、枸橼酸钠组下降幅度最小，在3个加以抗凝剂组别中，肝素组仍为最高，但三者与手术组比较，有显著的统计学差异(p＜0.05);灌流第30分钟，手术组Fib为6.14±0.88g/L，肝素组Fib值下降到5.52±1.01g/L;60分钟与120分钟两个时间点中，手术组因凝血而灌流被迫中断Fib值不测;三种抗凝剂组都随时间延长而Fib值缩小，肝素最为显著，在120分钟时测得Fib为3.46±0.73g/L，而枸橼酸钠作用最平缓，除手术组外，其余组别无出现DIC现象。
　　 6)灌流过程中，枸橼酸组以及水蛭素组均无皮肤粘膜出血和（或）手术创口渗血，滤器无凝血;肝素组有1只手术创口渗血和1只粘膜出血（均注射鱼精蛋白拮抗后恢复），滤器无凝血;手术组灌流过程中灌流器均因凝血而堵塞并导致蠕动泵无法转动，灌流器停止工作，时间为44.45±13.27min。各组之间的动物生存时间无统计学差异(p＞0.05)。
　　 结论:
　　 抗凝剂辅助血液灌流能够改善脓毒症过程中的凝血---抗凝系统紊乱，避免发展到DIC。
　　 在脓毒症血液灌流中应用枸橼酸，水蛭素，肝素钠抗凝均能在一定程度上改善凝血障碍;枸橼酸安全、有效，为三者首选。

目录

摘要

前言

第一章 兔脓毒症及动静脉置管模型的制备

1 兔脓毒症模型的制备

2 股动静脉置管

3 模型讨论：

第二章 不同抗凝剂血液灌流对脓毒症兔作用及安全性影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

综述

参考文献

学位期间成果

致谢

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